Análisis molecular del gen ornitina descarboxilasa de Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid como factor de patogenicidad en Phaseolus vulgaris L

Abstract

RESUMEN: Las poliaminas son policationes alifáticos de origen orgánico esenciales para todos los seres vivos, que se encuentran implicadas en múltiples procesos celulares relacionados con el crecimiento, proliferación y diferenciación, razón por la cual tienen una relación directa con el proceso patogénico de los hongos fitopatógenos. El metabolismo de las poliaminas ha sido ampliamente documentado y se encuentra bien descrito, sin embargo, se desconocen los detalles moleculares del mecanismo de acción de estos compuestos. La ornitina descarboxilasa (ODC) cataliza la síntesis de putrescina, reacción enzimática determinante para el anabolismo de las poliaminas, que ha permitido demostrar experimentalmente la relación que existe entre estos policationes y la virulencia. En este estudio se describe la secuencia clonada del gen ODC de Macrophomina phaseolina(Tassi) Goid, que fue utilizada para predecir la estructura primaria de la proteína, misma que fue comparada con otras ODC fúngicas, así como también, el modelamiento tridimensional de su estructura, basado en proteínas homólogas. Se presenta además, un análisis de la región promotora que permitió la clonación y secuenciación de las regiones no traducidas 5´y 3’ (UTR) para determinar el inicio de la transcripción (tsp), las señales y sitio de poliadenilación. El análsisi in silico de la región regulatoria permitió predecir veinticinco dominios de unión a factores de transcripción que sugieren la presencia de un mecanismo de regulación transcripcional mediado por diversos estímulos ambientales, tales como pH, salinidad, y estrés hídrico, que indican que la ODC es un elemento clave para la respuesta adaptativa del microorganismo y potencia su virulencia. Así mismo, se evaluó el impacto de la inhibición química de la ODC sobre el crecimiento vegetativo de M. phaseolina, usando el inhibidor competitivo 1,4-diiamino-2-butanona (DAB), el cual tuvo un efecto dosis dependiente, que generó una reducción significativa de la tasa de crecimiento, demostrando la función de las poliaminas como promotores del crecimiento micelial, indispensable para el proceso invasivo de este necrótrofo, en sus múltiples hospedantes. Teniendo en cuenta el impacto deletéreo de la pudrición carbonosa producida por M. phaseolina en más de 500 especies vegetales de importancia agroeconómica, se establecieron ensayos de interacción con dos variedades de Phaseolus vulgaris L. (frijol común), con la finalidad de evaluar la actividad transcripcional del gen por PCR cuantitativa en tiempo real, durante la patogénesis. Sin embargo, no fue posible cuantificar el transcrito debido a los bajos niveles de expresión que exhibió el microorganismo, bajo las condiciones experimentales ensayadas.

ABSTRACT: Polyamines are organic aliphatic polycations essential for all living organisms, which are involved in several cellular and molecular processes related to growth, proliferation and differentiation. In consequence, they are involved in the pathogenicity process of phytopathogenic fungi. Even though the study of polyamines metabolism has been well documented, the molecular aspects of its mechanism of action are still unknown. Ornithine decarboxylase (ODC) catalyzes the synthesis of putrescine, an important step for polyamines anabolism, which has allowed to experimentally shown the relationship between polyamines and virulence. This study described the sequence of the cloned ODC gene of Macrophomina phaseolina, which was utilized to predict the protein primary structure and subsequently compare it against other fungal ODCs, as well as the molecular modelling based in homologous proteins. The promotor region was also analyzed and used to clone and sequence the 5’ and 3´untranslated regions (UTR) in order to know the transcription start point (tsp), as well as the polyadenilation site and signals. The in silico analysis of the promoter region allowed to predict twenty five transcription factor-binding sites, suggesting a transcription regulatory process influenced by environmental stimuli such as pH, salinity and osmotic stress and pointing out the role of ODC as a key element in the adaptive response of M. phaseolina, enhancing its virulence. Furthermore, the chemical inhibition of ODC was evaluated in order to know its impact on vegetative growth using the competitive inhibitor 1, 4 diamino -2- butanone (DAB), which caused a dose-dependent effect. The use of DAB impaired the growth rate and caused a significant reduction, demonstrating the role of polyamines as positive promoters of the mycelial growth, essential for the invasive process of this necrotrophic organism in several hosts. XIX Taking into account the negative impact of the charcoal root caused by M. phaseolina in more than five hundred economically important plants, interaction tests with Phaseolus vulgaris L. (common bean) were established in order to assess the transcriptional activity of the ODC gene by quantitative real-time PCR during the pathogenesis process. However, transcript quantification was not possible due to the low expression levels exhibited by M. phaseolina under the experimental conditions tested.