Obtención de dos construcciones genéticas que permitan interrumpir los genes ALK1-CYP52 y ALK2-CYP52 de Debaryomyces hansenii

Abstract

RESUMEN: Los citocromos P450 codificados por la familia de genes CYP52 son enzimas que tienen como sustrato principal n-alcanos (lineales o ramificados) y ácidos grasos principalmente. Las enzimas de estudio son capaces de oxidar estos compuestos mediante una reacción de hidroxilación como primer paso de las rutas metabólicas encargadas de su degradación. Estas enzimas son claves para evaluar la capacidad hidrocarbonoclasta en diversas levaduras, principalmente del orden Saccharomycetales, mismas que poseen diversas subfamilias familia de genes CYP52. Debaryomyces hansenii es una levadura halotolerante de importancia biotecnológica que ha sido aislada periódicamente a partir de ambientes contaminados por derrames de petróleo. El genoma de esta levadura alberga 5 genes CYP52, de los cuales la expresión de los genes ALK1 y ALK2 es inducible en presencia de n-alcanos como única fuente de carbono disponible. Para elucidar la función de estos genes, en este trabajo, se diseñaron dos construcciones genéticas que permitirán obtener cepas mutantes de D. hansenii, carentes de los genes ALK1-CYP52 y ALK2-CYP52, para su posterior caracterización. La obtención de las construcciones genéticas se realizó por dos técnicas, las cuales fueron PCR de doble fusión (DJ-PCR) y por interrupción insercional, teniendo éxito con la segunda técnica. Una vez obtenidas las construcciones genéticas, dos métodos de electroporación para transformar a D. hansenii fueron ensayados, sin embargo, no se lograron obtener las mutantes hasta el momento. Si bien son necesarios más esfuerzos para lograr interrumpir los genes blanco, las construcciones genéticas construidas permitirán obtener mutantes de D. hansenii carentes de los genes ALK1-CYP52 y ALK2-CYP52, o de ser necesario, se podrá partir de estas construcciones para el rediseño de construcciones genéticas que permitan obtener las mutantes deseadas y caracterizar la función y expresión de los genes de estudio.