Estandarización de una PCR múltiple para la detección de Yersinia enterocolitica y Aeromonas spp., en muestras diarreicas

Abstract

RESUMEN: Yersinia enterocolitica y Aeromonas spp., son dos microorganismos que causan un síndrome diarreico, sin embargo, en México su búsqueda no se lleva a cabo de manera rutinaria. Estos dos géneros afectan a personas de todas las edades principalmente a los niños menores de 5 años por lo que determinar su incidencia es importante. Para la identificación de estos microorganismos se utilizan esencialmente los métodos convencionales no obstante, se han implementado los métodos de biología molecular que son herramientas diagnósticas confiables, rápidas, sensibles y específicas. El objetivo del presente trabajo fue estandarizar y evaluar un método de biología molecular como lo es la PCR múltiple (PCRm) para la detección simultánea de Y. enterocolitica y Aeromonas spp. Se inoculó intencionalmente una muestra de heces con cepas tipo de Y. enterocolitica ATCC 23715T y A. hydrophila ATCC 7966T . Posteriormente, se extrajo el DNA metagenómico por la técnica fenol-cloroformo para llevar a cabo la PCRm y demostrar la presencia de los genes ail de 439 pb y el yst de 130 pb para Y. enterocolitica, y el gen gcat de 237 pb para Aeromonas spp. La PCRm implementada se aplicó en un total de 81 muestras de heces diarreicas provenientes de pacientes de 2 lugares diferentes, se les extrajo el DNA metagenómico por la técnica fenolcloroformo. En las muestras proporcionadas por el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) (n=50), no se detectó la presencia de Aeromonas spp., ni de Y. enterocolitica. De las muestras del Hospital de Especialidades CMN la Raza del área de Hematología (n=31), Se detectó la presencia de Aeromonas spp., en el 3.22 % (n=1) y en ninguna de las muestras se detectó a Y. enterocolitica. Adicional a lo anterior se confirmó la presencia de Aeromonas spp., mediante la detección de los genes lafA de 734 pb y aer/hem de 431 pb, ambos, factores putativos de virulencia del género Aeromonas. Simultáneamente en las muestras del HECMNR se utilizó el sistema FilmArray que cuenta con un panel gastrointestinal e identifica 22 patógenos y dentro de éstos se encuentra Y. enterocolitica, confirmando con éste sistema la ausencia de Y. enterocolitica. ABSTRACT: Yersinia enterocolitica and Aeromonas spp., Are two microorganisms that cause a diarrheal syndrome, however, in Mexico their search is not carried out routinely. These two genera affect people of all ages, mainly children under 5 years of age, so determining their incidence is important. For the identification of these microorganisms the conventional methods are essentially used, however, molecular biology methods have been implemented which are reliable, fast, sensitive and specific diagnostic tolos. The objective of the present work was to standardize and evaluate a method of molecular biology such as multiple PCR (PCRm) for the detection of Y. enterocolitica and Aeromonas spp. A stool sample was intentionally inoculated with Y. enterocolitica strains ATCC 23715T and A. hydrophila ATCC 7966T . Subsequently, the metagenomic DNA was extracted by the phenolchloroform technique to carry out PCRm. PCRm showed the three amplicons corresponding to the ail genes of 439 bp and the 130 bp yst for Y. nterocolitica, and the gcat gene of 237 bp for Aeromonas spp. Implemented PCRm was applied in a total of 81 samples of diarrheic feces from 2 different places, the metagenomic DNA was extracted by the phenol-chloroform technique. In the samples provided by the Institute of Epidemiological Diagnosis and Reference (InDRE) (n = 50), the presence of Aeromonas spp., Or of Y. enterocolitica was not detected. From the specimens of the Hospital of Specialties CMN the Race of the area of Hematology (n = 31), the presence of Aeromonas spp., was detected in 3.22% (n = 1) and in none of the samples was detected to Y. enterocolitica. In addition, the presence of Aeromonas spp., was confirmed by detection of the lafA genes of 734 bp and aer / hem of 431 bp, both of which were putative virulence factors of the Aeromonas genus. Simultaneously, the FilmArray system was used, which has a gastrointestinal panel and identifies 22 pathogens, and within them Y. enterocolitica is found, confirming the absence of Y. enterocolitica with this system.