Abstract:
RESUMEN: La capacidad de Thermococcus gammatolerans para sobrellevar los daños provocados por las condiciones extremas en las que habita (elevadas temperaturas, niveles de presión, radiación, etc.), hacen de este microorganismo, un buen modelo de estudio para el análisis de sus enzimas. Por lo anterior, se seleccionó la ADN polimerasa B de T. gammatolerans (TgPolB) como modelo de trabajo para el análisis de su expresión. Dada la gran similitud estructural y el alto valor de identidad que comparte con otras ADN pol B, se buscó obtener resultados similares, bajo un sistema de expresión semejante al utilizado en otras enzimas homólogas. Para esto, se realizó una exhaustiva revisión bibliográfica, utilizando como referencia la información previamente publicada para modelos similares. El primer paso fue la amplificación del gen de TgPolB a partir del ADN genómico de T. gammatolerans, el cual fue clonado en el vector pJET 1.2 Bluntcloning, y subclonado en los vectores de expresión pColdI y pET19b. Estas construcciones fueron confirmadas por medio de PCR, ensayo de doble restricción y secuenciación. Los resultados obtenidos a partir de la expresión en las cepas de Rosetta II y BL21 (DE3) con diferentes condiciones de inducción, no mostraron expresión con ninguna de las construcciones analizadas independientemente del medio de cultivo (Luria Bertani, Super broth, 2XYT), temperatura (35°C y 16°C), tiempo de inducción (4 y 16 hrs) o concentraciones de inductor utilizados (0.25, 0.5, 1 y 1.25 mM). Por su parte, las pruebas de purificación no permitieron la obtención de TgPolB, por lo que es probable que presente cambios estructurales que impidan su identificación por el método de Western-Blot. Finalmente se propone el uso de 4 estrategias de trabajo derivadas de los resultados obtenidos: 1) uso de cepas de expresión codón-plus; 2) optimización del gen; 3) subclonación preferentemente simultánea en diferentes vectores de expresión; y 4) cambiar el sistema de expresión. ABSTRACT: Thermococcus gammatolerans capability to survive the damage caused by the extreme conditions in which it lives (high temperatures, pressure levels, radiation, etc.), makes this microorganism a good study model for the analysis of its enzymes. Therefore, the DNA polymerase B from family B of T. gammatolerans (TgPolB), was selected as a working model for the analysis of its expression. Given the great structural similarity and the high identity value that this enzyme shares with other DNA polymerases from family B, we sought to obtain similar results by inducing the protein expression under an expression system similar to that used in other homologous enzymes. To achieve this, an exhaustive bibliographical review was carried out, using as reference the previously published information for similar models. The TgpolB gene was amplified from the genomic DNA of T. gammatolerans, which was cloned into pJET1.2 Blunt Cloning Vector and subcloned into the expression vectors pCold and pET19b. These constructions were confirmed by PCR, double restriction and sequencing. The results obtained from the expression in the strains of Rosetta II and BL21 (DE3) with different induction conditions, demonstrate that the absence of expression is not due to the culture medium (Luria-Bertani, SuperBroth, 2XYT), temperature (35°C y 16°C), induction time (4, 16 hrs) or inductor concentrations used (0.25, 0.5, 1 y 1.25 mM). On the other hand, purification tests didn’t allow to obtain TgPolB, , so it is likely to present structural changes that prevent its identification by the Western-Blot method. Finally, the use of four work strategies derived from the obtained results is proposed in order to achieve protein expression: 1) use of codon-plus expression strains 2) gene optimization 3) subcloning preferably simultaneous in different expression vectors 4) change the expression system.
Description:
Tesis (Maestría en Ciencias en Manejo de Recursos Marinos), Instituto Politécnico Nacional, CICIMAR, 2018, 1 archivo PDF, (85 páginas). tesis.ipn.mx