ABSTRACT: Candida glabrata is a haploid and non-dimorphic yeast phylogenetically more related to Saccharomyces cerevisiae than to any other pathogenic yeast of the genus Candida. The species currently occupies the second place as a causative agent of candidiasis, it is sometimes difficult to treat it because some isolates have innate resistance to fungicide agents as fluconazole. Since the aspartyl proteases are widely distributed in the pathogenic yeast of the genus Candida, and have been considered virulence factors, the objective of this study was to explore, through bioinformatics tools, aspartyl protease coding genes in the genome of C. glabrata. We found 13 aspartyl protease coding genes, 9 of which are located on chromosome E, 8 of them in tandem (YPS2-6 and YPS8-11), the rest of the genes are found on chromosomes A (YPS7, M (YPS1 and PEP4) and J (YPS12) in the genome of C. glabrata. All translated sequences of these genes have typical aspartyl proteases structures, 12 of them have extracellular location (YPS1-12) and one probably has vacuolar location (PEP4). Most products have a probable GPI bindig site (YPS1-2 and YPS5-11) which makes them similar to those of S. cerevisiae yapsines and the Sap 9 and 10 of C. albicans, suggesting that they might be involved in maintaining the integrity of the cell surface and in the processing and maturation of other proteins that might be involved in virulence. The upstream regions have regulatory binding sites for activating factors regulated by nitrogen (except YPS7 gene) and some sites may be responsive to stress. To see if the expression of these proteases is related to the interaction with the host cell, it was determined the transcriptional gene expression profile of CgYPS genes during the in vitro infection of HeLa epithelial cells, by RTPCR. The CgYPS genes showed a differential expression during the infection of HeLa cells. The YPS1, YPS2, YPS4, YPS5, YPS8, YPS9, YPS10, YPS11, PEP4 and EPA1 C. glabrata genes increased their expression under the epithelial cells presence. CgYPS2, CgYPS5 and CgPEP4 genes of the non-adherent yeast increased significantly their expression. The genes that can be related to the adherence process are CgYPS5, CgYPS8 and CgYPS11. CgYPS7 and CgYPS12 not express under any of the conditions tested. These results will enable us to select candidates to get null mutants in yapsines, the characterization of the mutants, will allow us to infer the role of these proteases in the process of infection and/or integrity of the wall of C. glabrata.
RESUMEN: Candida glabrata es una levadura haploide, no dimórfica que está más relacionada filogenéticamente a Saccharomyces cerevisiae que a cualquier otra levadura patógena del género Candida. Esta especie ocupa actualmente el segundo lugar como agente causal de candidosis, en ocasiones es de difícil tratamiento ya que algunos aislamientos presentan resistencia innata a agentes fungicidas como el fluconazol. Ya que las aspartil proteasas se encuentran ampliamente distribuidas en las levaduras patógenas del género Candida y han sido consideradas factores de virulencia, el objetivo de este trabajo fue el de buscar, mediante herramientas bioinformáticas, genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de C. glabrata. Se encontraron trece genes codificantes de aspartil proteasas en el genoma de C. glabrata, nueve de los cuales se encuentran en el cromosoma E, ocho en tándem (YPS2-6 y YPS8-11), el resto se encuentran en los cromosomas A (YPS7), M (YPS1 y PEP4) y J (YPS12). Todas las secuencias traducidas de estos genes presentan estructuras típicas de aspartil proteasas, 12 de ellas tienen una localización extracelular (YPS1-12) y una de ellas es probablemente de localización vacuolar (PEP4). La mayoría de los productos codificados presentan un probable sitio GPI (YPS1-2 y YPS5-11) lo que las hace similares a las yapsinas de S. cerevisiae y a la Sap 9 y 10 de C. albicans lo que sugiere que podrían estar implicadas en el mantenimiento de la integridad de la superficie celular así como en el procesamiento y maduración de otras proteínas que podrían participar en la virulencia. Las regiones reguladoras tienen sitios de unión a activadores de genes regulados por nitrógeno (excepto el gen YPS7) y algunos tienen sitios de activación por respuesta a estrés. Para ver si la expresión de estas proteasas está relacionada con la interacción con las células del hospedero, se determinó el perfil de expresión de los genes CgYPS a nivel transcripcional mediante RT-PCR durante la infección in vitro de células epiteliales HeLa. Los genes CgYPS mostraron una expresión diferencial durante la infección del cultivo celular HeLa. YPS1, YPS2, YPS4, YPS5, YPS8, YPS9, YPS10, YPS11, PEP4 y EPA1 de C. glabrata aumentaron su expresión por la presencia de células HeLa. CgYPS2, CgYPS5 y CgPEP4 mostraron expresión significativa en las levaduras no adheridas. CgYPS5, el CgYPS8 y CgYPS11 pueden asociarse al proceso de adherencia. CgYPS7 y CgYPS12 no se expresaron en ninguna de las condiciones probadas. Los resultados obtenidos nos permitirán seleccionar a los genes candidatos para ser mutados, la caracterización de mutantes deficientes de yapsinas permitirá inferir el papel que desempeñan estas proteasas en los procesos de infección y/o en la integridad de la pared de C. glabrata.
