Estudio bioquímico y molecular de las proteasas vacuolares de Candida glabrata

Abstract

RESUMEN: Candida glabrata es la segunda o tercera causa más común de candidosis sistémica después de C. albicans. Durante los últimos años se ha convertido en un nuevo modelo ya que esta especie está más relacionada filogenéticamente con Sacharomyces cerevisiae que con cualquier otra especie patógena del género Candida. Las proteasas intracelulares y en especial las vacuolares juegan un papel fundamental en el recambio proteico y en el control post-traduccional, sin embargo, poco se sabe acerca de las proteasas vacuolares de C. glabrata. En este trabajo en el genoma de C. glabrata se detectaron los siguientes genes putativos codificantes de proteasas vacuolares, homólogos a los existentes en S. cerevisiae: gen PEP4cg (codificante de una proteasa ácida PrAcg), PRB1cg, PRB2cg, PRB3cg (proteasas neutras PrB1cg, PrB2cg y PrB3cg), LAP4cg y APE3cg (aminopeptidasas ApeIcg y ApeYcg), PRC1cg y CPScg (carboxipeptidasas CpYcg y CpScg) y DAP2cg (dipeptidil aminopeptidasa DapBcg). El análisis de las proteínas deducidas de las secuencias nucleotídicas arrojó los siguientes resultados: PrAcg es una proteína de 45.4 kDa con un pI de 4.6, las pruebas de inhibición comprobaron que se trata de una aspartil proteasa. Las proteasas PrB1cg, PrB2cg y PrB3cg presentan PM de 50, 53.4 y 63.5 kDa y pI de 5.7, 6.1 y 4.9, respectivamente, la actividad bioquímica sugiere que se trata de serín proteasas. Las aminopeptidasas ApeIcg y ApeYcg presentan PM de 57 y 62.2 kDa y pI de 6.0 y 5.4 respectivamente, la ApeYcg es una metaloaminopeptiodasa. Las carboxipeptidasas CpYcg y CpScg presentan PM de 65 y 57.2 y pI de 4.9 y 5.2, respectivamente, se comportaron como serín proteasas. La DapBcg presenta PM de 94 y pI de 5.4, se comportó como serínproteasa. Todas las proteasas estudiadas presentan características bioquímicas semejantes a las reportadas para S. cerevisiae, se detectaron principalmente en la fracción soluble, a excepción de la actividad DapBcg que se localizó además en la fracción membranal. Se confirmó que las actividades PrAcg, ApeIcg, ApeYcg y CpYcg, se encuentran en la vacuola de C. glabrata. La expresión de los genes codificantes de proteasas vacuolares está regulada de manera diferencial por las fuentes de N y C. Las proteasas codificadas por los genes PEP4cg, PBR2cg Y LAP4cg muy probablemente participen en el recambio proteico inducido por estrés por fuente de N inducido por prolina, PBR2cg fue el único gen que se sobreexpresó en ausencia de una fuente de N. Se clonó el gen completo codificante de la proteasa PrAcg (PEP4cg), para su posterior expresión heteróloga.