Caracterización del gen ape3 que codifica una aminopeptidasa en Ustilago maydis

Abstract

RESUMEN: En este trabajo se caracterizó el gen ape3 de Ustilago maydis. La proteína recombinante presentó actividad aminopeptidásica. El análisis bioinformático del genoma de U. maydis indicó la presencia de un ORF de 1 649 pb, homólogo al gen ape3 de Saccharomyces cerevisiae, la proteína predicha es de 506 aminoácidos, con un peso molecular 53.6 kDa. La proteína deducida presenta un motivo característico de las metalopeptidasas pertenecientes a la familia de las aminopeptidasas Y (M28), así como sitios de fosforilación, N-meristilación y N-glicosilación. En el extremo 5 ? del gen se reporta un intrón de 131 pb. Mediante pruebas de RT-PCR se encontró que este intrón no es procesado en transformantes de P. pastoris. El intrón debe de ser procesado para poder detectar la actividad de aminopeptidasa. Los fragmentos ape3a (con intrón) y ape3b (sin intrón) del gen ape3, codificante de una aminopeptidasa fueron clonados en los vectores de expresión pPICZ?A y pPICZA. La expresión heteróloga del gen ape3 en Pichia pastoris se indujo cuando las transformantes se crecieron en un medio mínimo con metanol. La actividad bioquímica confirmó que el gen ape3 codifica una enzima con actividad aminopeptidásica La actividad bioquímica fue detectada en un extracto libre de células de un cultivo de P. pastoris de 72 h. La enzima hidrolizó preferencialmente substratos como pro-pNA y arg-pNA. El análisis de expresión por RT-PCR cultivando a Ustilago maydis en diferentes fuentes de nitrógeno, carbono e inaniciones, sugiere que el gen ape3 está regulado por la fuente de nitrógeno disponible y condiciones de estrés nutricional.