RESUMEN: Recientemente nuestro grupo demostró que la Muerte Celular Programada (MCP) en Entamoeba histolytica, es inducida in vitro por el antibiótico aminoglicósido G418. En este trabajo estudiamos la expresión diferencial de genes durante etapas tempranas de MCP inducida por G418, para determinar si los cambios bioquímicos y morfológicos de la muerte celular, coinciden con los cambios moleculares que reflejen un programa genético. Utilizando la tecnología de cDNA- Polimorfismo de longitud en fragmentos amplificados (AFLP’s) y análisis in silico, demostramos una expresión diferencial en genes durante fases tempranas de MCP en E. histolytica inducida por G418. Los genes que identificamos codifican para proteínas homólogas a la Glutaminil-tRNA sintasa, las Subunidades Ribososmales 40S y 16S, a la Saposina-like, al Regulador silenciador de información-2 (Sir-2), y a las Graininas 1 y 2. Utilizando retrotranscripción y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-Q-PCR) encontramos que glutaminil t-RNA sintetasa, sir-2, graininas y saposina-like se sobreexpresaron 55.63, 122.52, 80.26, 132.11 y 194.09 veces mas respectivamente, en relación al control después de 30 min de la inducción de MCP, mientras que esta expresión disminuyó dramáticamente a los 60 min. Por otro lado la sobreexpresión de genes ribosomales incrementó solo 7 veces por arriba del nivel basal de expresión, mostrando una disminución progresiva después de los 90 min. Glutaminil t-RNA sintetasa, sir-2 y las graininas 1 y 2 pudieran estar actuando como reguladores negativos de la MCP, intentando controlar los cambios bioquímicos relacionados con la activación de dicho fenómeno. En contraparte, la sobreexpresión de
saposina-like, pudiera estar actuando como un regulador positivo de apoptosis activando algunas de las rutas de muerte celular.
Nuestros resultados dan evidencia de los primeros genes identificados durante estadios tempranos de MCP en E. histolytica, que pudieran estar implicados en la regulación de rutas apoptóticas.
ABSTRACT: Recently our group demonstrated that Programmed Cell Death (PCD) in Entamoeba histolytica, is induced in vitro by G418 aminoglycoside antibiotic. In this work we studied the differential gene expression during early stages of PCD induced by G418, to ascertain if biochemical and morphological changes previously observed are paired to molecular changes that reflect a genetic program.
Using cDNA-amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) and in silico derived analysis we showed in E. histolytica a differential gene expression during PCD induced by G418. The genes identified encoded for proteins homologous to Glutaminyl-tRNA synthase, Ribosomal Subunit Proteins 40S and 18S, Saposin- like, Silent Information Regulator-2 (Sir-2), and Grainins 1 and 2. Using real-time quantitative PCR (RT Q-PCR), we found that glutaminyl-tRNA synthetase, sir-2, grainins and saposin-like genes were overexpressed 55.63, 122.52, 80.26, 132.11 y 194.09 fold respectively, relative to control after 30 min of PCD induction, while it’s expression dramatically decreased up to 60 min. On the other hand, overexpression of ribosomal genes increased only 7 fold of basal expression, showing a progressive down regulation up to 90 min. glutaminyl-tRNA synthetase, sir-2 and grainins could act as negative regulators of PCD, trying to control the biochemical changes related to PCD activation. Overexpression of saposin-like gene could act as up regulator of some cell death pathways. Our results give evidence of the first genes identified during the early stage of PCD in E. histolytica that could be implicated in regulation of apoptotic pathways.
