ABSTRACT: The astrocitoma is one of the sorted cancer of worse outcome. Therefore, looking for new high specific and lower or lack secondary effects therapies is needed. One brand new therapy is chromatin modification (CMT), which involves the using of a compound capable of regulating the histone modifier enzymes such as the histone acetyltransferase (HATs). Due to chromatin on cancer is excessively relaxed, we hope that the use of HATs inhibiators hinder chromatin relaxation and repress transcription. Glycosaminoglycans molecules have proven having this activity, being heparine one of the most potent. Curcumin was used as a positive control because inhibits HATs. In the other hand phodynamic therapy (PDT) has proven being parcially efficient on the treatment of nervous system tumors. The aim of this work goal was to increment the PDT effectiveness while combaning this with TMC through Nheparin. Cell lines U373-MG and D54-MG (astrocytome, glioblastome) were cultured, as well as the control cell line HaCaT (keratinocytes inmortalized). The viability assesses in the cytotoxicity assay of the HATs inhibitors and the PDT assays were realized by the MTT method. The inhibition of HATs was determined by the Hoechst method and the histone acetylation by Western-blot. The reactive oxygen species were assessed by spectrofluorometry. PplX concentration was quantified by the Piomelli method modified for cell cultures. Results show that heparin did not have cytotoxic effect on cells at concentrations and times tested. The higher inhibitory effect of curcumin on HATs was obtained at 20μM/3h of exposition in U373-MG cells and 4μg/mL to heparin in the rest of the lines. The HATs inhibitors studied synergized the PplX accumulation when they were combined with ALA. The HATs inhibitors studied in this work have different molecular mechanisms to deal with acetylation histones inhibition, being probably heparin involved on the apoptosis regulation such as the curcumin case. The curcumin acts as a photosensitizer at 10 and 20μM since it raises the PDT efectiveness even with out the presence of ALA and it is much higher in cancer cells than on normal ones. This work proves that PDT increases its efectiveness while combining with CMT.
RESUMEN: El astrocitoma es uno de los tipos de cáncer con peor pronóstico, debido a esto es necesario buscar nuevas terapias con alto grado de especificidad y sin efectos secundarios. Una de las nuevas terapias es la de modificación cromatínica (TMC), que involucra la regulación de enzimas modificadoras de histonas como las acetiltransferasas de histonas (HATs). Debido a que en el cáncer la cromatina está relajada en exceso, esperamos que con el uso de inhibidores de las HATs estos impidan que la cromatina se relaje y transcriba. Los glicosaminoglicanos han mostrado tener esta actividad, siendo uno de los más potentes la heparina. Como sustancia de referencia para la inhibición de HATs se empleó la curcumina. Por otro lado la terapia fotodinámica (TFD), ha mostrado tener una eficiencia parcial en el tratamiento de tumores del sistema nervioso. El objetivo del presente proyecto fue aumentar la eficiencia de la TFD al combinarse con la TMC a través de la heparina N-Desulfatada. Se emplearon las líneas celulares U373-MG y D54-MG (astrocitoma anaplasico y glioblastoma multiforme respectivamente), y una línea control HaCat (queratinocitos inmortalizados). La determinación de la viabilidad en los ensayos de citotoxicidad de los inhibidores de HATs así como los de la TFD se realizaron por el método de MTT en las 3 líneas celulares. Se determinó la inhibición de la actividad de las HATs por el método de Hoechst y la acetilación de histonas por Western-blot. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se determinaron por fluorescencia. Se cuantificó la concentración de PplX por el método de Piomelli modificado para cultivos celulares. Los resultados muestran que la heparina no tuvo efecto citotóxico en las células a las concentraciones y tiempos probados. El mayor efecto inhibitorio de la curcumina sobre las HATs fue a 20?M por 3h de exposición en la línea U373-MG y para heparina fue de 4?g/mL en las 3 líneas celulares. Los inhibidores de HAT estudiados sinergizaron la acumulación significativa de la PpIX cuando se combinaron con el ALA. Los inhibidores de HAT estudiados en esta tesis tienen mecanismos moleculares diferentes para llevar a cabo la inhibición de la acetilación de histonas y muy probablemente la heparina esté involucrada con la regulación de la apoptosis como es el caso de curcumina. La curcumina actúa como fotosensibilizador a las concentraciones de 10 y 20?M por lo que aumenta la efectividad de la TFD aún sin la presencia del ALA y es mucho mayor en células cancerosas que en células normales. En este trabajo se demuestra que la TFD aumenta su eficiencia al combinarse con la TMC.
