RESUMEN
Las aplicaciones de la nanotecnología en la industria alimentaria son relativamente recientes si se comparan con otras áreas. Una de las principales aplicaciones de la nanotecnología se ha dirigido a la protección y estabilización de componentes bioactivos mediante la nanoencapsulación empleando métodos de alta energía. En el presente trabajo se planteó la elaboración de nanoestructuras físicamente estables mediante la aplicación de dos metodologías: emulsificación-homogeneización y emulsificación ultrasónica empleando una matriz lipídica que permitió el atrapamiento de componentes bioactivos lipofílicos.
Se elaboraron nanoemulsiones utilizando acido esteárico como fase oleosa, Tween 80 y agua Milli-Q como fase acuosa y la incorporación de β-caroteno y astaxantina extraída de H. pluvialis como componentes bioactivos empleando un método de emulsificación-homogeneización y un método de emulsificación ultrasónica. Para las nanoemulsiones de β-caroteno se evaluó el efecto del tiempo de homogeneización, la velocidad de agitación y la relación aceite:agua mediante la metodología de superficie de respuesta (MSR) aplicando un diseño central compuesto (DCC) con un total de 13 corridas experimentales y 3 repeticiones en el punto central. El tamaño de partícula y la estabilidad de las nanoemulsiones (color, concentración de β-caroteno y actividad antioxidante) almacenadas durante 21 días a 25 y 4 ºC fueron seleccionadas como variables respuesta. El tamaño de partícula osciló entre 418.8 a 1689.0 nm y fue afectado directamente por el tiempo de homogeneización e inversamente por la velocidad de agitación y la relación aceite:agua. Las nanoemulsiones de β-caroteno mostraron una coloración naranja-roja distintiva de los carotenoides, los valores de ángulo de tono se ubicaron en el cuadrante que abarca tonalidades del amarillo al rojo (+b* y +a*), indicando que el pigmento fue bien embebido en la matriz lipídica empleada como fase oleosa. Los parámetros de estabilidad (actividad antioxidante y concentración de β-caroteno) presentaron una disminución gradual durante el periodo de almacenamiento, mostrando una mayor estabilidad aquellas muestras que fueron almacenadas a 4 ºC. Las condiciones óptimas estimadas para elaborar nanoemulsiones de β-caroteno minimizando el tamaño de partícula para 25 °C fueron un tiempo de homogeneización de 5.99 min, una velocidad de agitación de 5287 rpm y una relación aceite:agua de 0.8:99.2; para 4 ºC el tiempo de homogeneización fue de 5.99 min, una velocidad de 8002 rpm y una relación aceite:agua de 0.62: 99.38.
A partir de los resultados anteriores se seleccionaron 5 formulaciones para incorporar las nanoemulsiones de β-caroteno a un alimento modelo (yogur) y evaluar su aplicación como fuente de pigmentación. Para obtener una tonalidad naranja similar a las existentes comercialmente se adicionó una relación 1:3 emulsión:yogur. Con esta relación los valores de pH de los yogures pigmentados fueron muy similares a los establecidos por la Norma Oficial Mexicana (NMX-F-444-1983) para yogur natural (≤ 4.5). Posteriormente, se evaluó la estabilidad del sistema con respecto a las diferencias de color (ΔE) durante un periodo de almacenamiento de 28 días. El valor de ΔE obtenido para los yogures pigmentados fue de entre 1.35 a 1.86, demostrando que los cambios de color no fueron perceptibles para el ojo humano.
Se elaboraron nanoemulsiones de ácido esteárico empleando un método de emulsificación ultrasónica Se evaluó el efecto de la concentración de lípido, la concentración de agente surfactante y el tiempo de sonicación mediante la metodología de superficie de respuesta (MSR) aplicando un diseño central compuesto (DCC) con un total de 20 corridas experimentales y 6 repeticiones en el punto central. El pH, la conductividad eléctrica, el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad, el índice de blancura y el potencial Z fueron seleccionadas como variables respuesta. El tamaño de partícula osciló entre 238.13 a 775.47 nm. Un efecto positivo sobre el
Resumen y Abstract
Elaboración de nanoestructuras poliméricas para la estabilización de componentes bioactivos II
tamaño de partícula se obtuvo al incrementar la concentración de Tween 80. Por otra parte, tamaños de partícula mayores fueron obtenidos cuando se incrementó la concentración de ácido esteárico y el tiempo de sonicación. Las condiciones óptimas estimadas para lograr minimizar la respuesta (tamaño de partícula) fueron 4.08% de ácido esteárico, 1.22% de Tween 80 con un tiempo de sonicación de 19.18 min para un tamaño de partícula estimado de 198.46 nm. Las formulaciones F9 y F10 presentaron los valores más altos de potencial Z (-43.56 y -36.30 mV). Los estudios con microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica (Cryo-TEM) revelaron formas esféricas y homogéneas. A partir de estos resultados se seleccionaron 5 formulaciones, las cuales fueron liofilizadas con la finalidad de obtener nanopartículas sólidas lipídicas (NSL). El análisis morfológico mostro nanoestructuras en forma de plaquetas con superficies rugosas. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) determinó que el ácido esteárico funde a una temperatura de 74.43 ºC con un valor de entalpía de fusión de 210.80 J/g, mientras que las formulaciones de NSL presentaron un punto de fusión entre 62.13 a 64.06 ºC y valores de entalpía de fusión entre 133.91 a 185.33 J/g.
Por otra parte, las nanoemulsiones de astaxantina elaboradas por un método de emulsificación ultrasónica presentaron tamaños de partícula entre 225.70 a 341.83 nm. Las formulaciones elaboradas fueron consideradas sistemas altamente estables con valores de potencial Z entre -26.60 y -30.76 mV. El análisis microscópico mediante Cryo-TEM permitió identificar formas esféricas y homogéneas en las nanoemulsiones de astaxantina. Posteriormente, estas formulaciones fueron liofilizadas con la finalidad de obtener NSL. La concentración residual del pigmento en el testigo (astaxantina libre) presentó un porcentaje de degradación superior comparado con las nanoemulsiones y las NSL de astaxantina. Las nanoemulsiones y las NSL de astaxantina presentaron pérdidas de actividad antioxidante menores al 50%. El análisis microscópico por SEM-HR permitió observar nanoestructuras en forma de plaquetas con una superficie rugosa para las NSL. El análisis de DSC indicó que la ausencia del pico de fusión de la astaxantina dentro de las formulaciones de NSL sugiere una correcta dispersión en la matriz lipídica.
Los resultados obtenidos sustentan la posibilidad de emplear nanoemulsiones y NSL para la incorporación de componentes bioactivos lipofílicos, permitiendo así su uso en el desarrollo de productos nutracéuticos de nueva generación en la industria alimentaria.
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Elaboración de nanoestructuras poliméricas para la estabilización de componentes bioactivos III.
ABSTRACT
The applications of nanotechnology in the food industry are relatively new compared with other areas. One of the main applications of nanotechnology has led to the protection and stabilization of bioactive compounds by nanoencapsulation using high-energy methods. The aim of this work was to develop physically stable nanostructures by an emulsification-homogenization and ultrasonic emulsification method using a lipid matrix that allowed the entrapment of lipophilic bioactive components.
Nanoemulsions were preparaed using stearic acid as the oil phase, Tween 80 and Milli-Q water as the aqueous phase and β-carotene and astaxanthin of H pluvialis as bioactive components by an emulsification-homogenization method and ultrasonic emulsification method. For the β-carotene nanoemulsions the effect of homogenization time, stirring speed and oil:water ratio was evaluated by a response surface methodology (RSM) applying a central composite design (CCD) with a total of 13 experimental runs and 3 repetitions at the central point. The particle size and stability of nanoemulsions (color, β-carotene concentration and antioxidant activity) stored for 21 days at 4 and 25°C were selected as response variables. The particle size obtained ranged between 418.8 to 1689.0 nm. The particle size was directly affected by the homogenization time and inversely by the stirring speed and the oil:water ratio. In addition, the nanoemulsions showed a distinctive orange-red color of the carotenoids, the values of hue angle (ºh) were located in the quadrant that includes shades from yellow to red (+ b* y + a*), indicating that the pigment was well embedded in lipid matrix used as the oil phase. The stability parameters (antioxidant activity and β-carotene concentration) showed a gradual decrease during the storage period, showing a greater stability the samples stored at 4 °C. Estimated optimal conditions to produce β-carotene nanoemulsions minimizing the particle size to 25 °C were a homogenization time of 5.99 min, a stirring speed of 5287 rpm and an oil:water ratio of 0.8:99.2; for 4 °C the homogenization time was 5.99 min, a stirring speed of 8002 rpm and an oil:water ratio of 0.62:99.38.
Based on the above results, five formulations were selected for incorporating the β-carotene nanoemulsions to a model food (yogurt) and evaluate its application as a source of pigmentation. To obtain an orange coloration similar to existing commercially a ratio 1:3 emulsion:yogurt was added. With these relationship pH values of pigmented yogurts were very similar to those established by the Norma Oficial Mexicana (NMX-F-444-1983) for natural yogurt (≤ 4.5). The stability with respect to color difference (ΔE) was evaluated during 28 days. The ΔE obtained for pigmented yogurts ranged from 1.35 to 1.86, indicating that the color changes were not perceptible for the human eye.
Stearic acid nanoemulsions by ultrasonic emulsification method were evaluated regarding the effect of lipid and surfactant concentration and the sonication time. Response surface methodology (RSM) was applyed with a central composite design (CCD) with a total of 20 experimental runs and 6 repetitions at the central point. pH, electrical conductivity, particle size, polydispersity index, whiteness index and Z-potential were the response variables. The particle size obtained ranged between 238.13 to 775.47 nm. A positive effect on the particle size was obtained by increasing the concentration of Tween 80. On the other hand, larger particle sizes were obtained when the concentration of stearic acid and the sonication time was increased. Optimal conditions to achieve minimize estimated response (particle size) were 4.08% stearic acid, 1.22% Tween 80 with a sonication time of 19.18 min for an estimated particle size of 198.46 nm. F9 and F10 formulations showed the highest values of Z-potential (-43.56 and -36.30 mV). The transmission electron
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Elaboración de nanoestructuras poliméricas para la estabilización de componentes bioactivos IV
microscopy by a cryogenic temperature (Cryo-TEM) revealed spherical and homogeneous forms. Five of these formulations were selected and then were lyophilized in order to obtain solid lipid nanoparticles (SLN). SLN morphology exhibited nanostructures like a platelets with rough surfaces. The differential scanning calorimetry (DSC) showed that stearic acid melts at 74.43 °C with an enthalpy value of 210.80 J/g, while the formulations of SLN had a melting point between 62.13 to 64.06 °C with an enthalpy values between 133.91 to 185.33 J/g.
By other hand, astaxanthin nanoemulsions prepared by ultrasonic emulsification method showed particle sizes between 225.70 to 341.83 nm. The formulations obtained were considered highly stable systems with zeta potential values between -26.60 and -30.76 mV. Spherical forms and homogeneous droplets were identified by Cryo-TEM in astaxanthin nanoemulsions. These formulations were lyophilized in order to obtain SLN. The residual concentration of pigment in the control (free astaxanthin) had a higher percentage of degradation compared with astaxanthin nanoemulsions and SLN. Astaxanthin nanoemulsions and SLN showed an antioxidant activity losses lower than 50%. Microscopic analysis by SEM-HR for SLN allowed observing nanostructures in the form like platelets with a rough surface. DSC analysis indicated that the absence of the melting peak of astaxanthin in SLN formulations suggesting the correct dispersion in the lipid matrix.
