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Expression, purification, pull-down analysis and insect bioassay of immunosuppressant protein, CrV1 of cotesia rubecula polydnavirus (CrPDV)

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dc.contributor.author Wei, Lihua
dc.date.accessioned 2018-04-30T16:54:11Z
dc.date.available 2018-04-30T16:54:11Z
dc.date.created 2015-06-29
dc.date.issued 2018-04-09
dc.identifier.citation Wei, Lihua. (2015). Expression, purification, pull-down analysis and insect bioassay of immunosuppressant protein, CrV1 of cotesia rubecula polydnavirus (CrPDV). (Doctorado en Ciencias en Biotecnología). Instituto Politécnico Nacional, Centro de Biotecnología Genómica. México. es
dc.identifier.uri http://tesis.ipn.mx/handle/123456789/24630
dc.description Tesis (Doctorado en Ciencias en Biotecnología), Instituto Politécnico Nacional, CBG, 2015, 1 archivo PDF, (178 páginas). tesis.ipn.mx es
dc.description.abstract RESUMEN: Los polidnavirus (PDVs) son simbiontes de avispas parasitoides como una estrategia natural para evadir la defensa inmune de los lepidopteros hospederos. Los PDVs son virus de ADN circular de hebra, son encontrados en algunas familias de Ichneumonoidea, son clasificados como bracovirus (BV) o ichnovirus (IV) dependiendo el parasitoide hospedero y la morfología viral. Un producto génico de los BV de la avispa parasitoide Cotesia rubecula es la proteína CrV1, la cual inhibe la respuesta del sistema imnune del lepidóptero hospedero endoparasitado, a través de la interferencia con la estructura del citoesqueleto del hemocito. El mecanismo de inactivación permanece no claro. En este estudio, el gen CrV1 fue insertado en 2 vectores de transferencia, pAcGHLT-B y pAcUW21 y cotransfectado para generar dos baculovirus recombinantes pAcGHLT-B-CrV1 y pAcUW21-CrV1. La proteína de fusión GST-CrV1 fue expresada exitosamente y purificada de las células Sf9 infectadas con el baculovirus pAcGHLT-B-CrV1. El ensayo ―GST pull-down‖ fue llevado a a cabo para estudiar la interacción de la proteína CrV1 en lisado de larvas de Pieris rapae. Sin embargo se observó la degradación de la proteína GST-CrV1, probablemente debida a alguna sustancia presente en el lisado. Un lisado de larvas de Spodoptera exigua fue también usado para ensayos ―GST pull-down‖ y la degradación también fue detectada en este caso. El contenido de sustancias en el lisado aun es desconocido, algunos experimentos previos han demostrado que algunas proteasas que consisten en ARN pueden estar involucradas en la degradación. Los baculovirus recombinantes pueden ser usados como insecticidas biológicos por medio de la introducción y expresión de genes exógenos tales como los que codifican para proteínas que interfieren con el metabolismo, metamorfosis (toxinas, hormonas y enzimas) y con el sistema inmune. La proteína CrV1 secretada por el polidnavirus de Cotesia rubecula es responsable de la depolimerizacion de la actina en los hemocitos y abolición de las funciones del sistema inmune tales como la fagocitosis y la difucion celular, lo cual permite el exitoso desarrollo embrionario de la avispa parasitoide. En este estudio el baculovirus pAcUW21-CrV1 fue probado contra los insectos plaga Spodoptera exigua y Pieris rapae. El virus recombinante que expresa CrV1 mostró una LC50 y una LT50 significativamente más bajas comparado con el virus tipo silvestre, lo cual indica que solo la expresión de CrV1 en los baculovirus recombinantes puede mejorar la virulencia. ABSTRACT: Polydnaviruses (PDVs) are symbionts of parasitoid wasps as a natural strategy to overcome the immune defense of the lepidopteran host. PDVs are double-stranded, circular DNA viruses found in some Ichneumonoidea families, being classified as bracovirus (BV) or ichnovirus (IV) according to the host parasitoid and viral morphology. One gene product of the BV of the parasitic wasp Cotesia rubecula, CrV1, inhibits the immune system responses of its endoparasitized lepidopteran host through interference with the haematocyte cytoskeletal structure. The mechanism of inactivation is still not clear. In this study, CrV1 was constructed into two transfer vectors, pAcGHLT-B and pAcUW21 and co-transfected to generate two baculoviruses, pAcGHLT-B-CrV1 and pAcUW21-CrV1. GST-CrV1 fusion protein was successfully expressed and purified from pAcGHLT-B-CrV1 baculovirus infected Sf9 cells. GST pull-down assay was carried out to study the interacted proteins of CrV1 in Pieris rapae larvae lysate. However, degradation of GST-CrV1 protein was present. This degradation may due to the some kinds of materials existed in the lysate. Another insect larvae lysate, Spodoptera exigua, was also used for pull-down assay and the degradation was also detected. The contents of the materials are still unknown and another experiment showed that protease consisting of RNA may involve in the degradation. Recombinant baculoviruses may be used as biological insecticides by the introduction and expression of exogenous genes such as those coding for proteins interfering with metabolism, metamorphosis (toxins, hormones, and enzymes), and immune system. The CrV1 secreted protein of Cotesia rubecula polydnavirus (PDV) is responsible for the actin depolymerization in hemocytes and the abolishment of immune functions such as phagocytosis and cell spreading, thus allowing the successful embryonic development of the parasitoid wasp. In this study, pAcUW21-CrV1 baculovirus was tested against the insect pests Spodoptera exigua and Pieris rapae. The recombinant virus expressing CrV1 protein showed significantly lower LC50 and LT50 as compared with wild-type virus, which indicated that the recombinant baculoviruses expressing only CrV1 gene can improve their virulence. es
dc.description.sponsorship CONACYT, IPN es
dc.language.iso en es
dc.subject Pieris rapae es
dc.subject Spodoptera exigua es
dc.subject Proteína es
dc.subject Baculovirus es
dc.subject Pull-down es
dc.subject Expresión es
dc.subject Purificación es
dc.subject Polidnavirus (PDVs) es
dc.subject Proteína CrV1 es
dc.title Expression, purification, pull-down analysis and insect bioassay of immunosuppressant protein, CrV1 of cotesia rubecula polydnavirus (CrPDV) es
dc.title.alternative Expression, purification, pull-down analysis and insect bioassay of immunosuppressant protein, CrV1 of cotesia rubecula (CrPDV) polydnavirus es
dc.type TESIS es
dc.contributor.advisor Rodríguez Pérez, Mario Alberto
dc.contributor.advisor Brieba de Castro, Luis Gabriel


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