Evaluación de la actividad citotóxica y construcción de una inmunotoxina (IT) de curcina obtenida de semillas de Jatropha Curcas L

Abstract

RESUMEN: La curcina es una proteína inactivadora de ribosomas (RIP) que se encuentra en el endospermo de semillas de Jatropha curcas, es una enzima N-glicosidasa que actúa sobre el ARNr bloqueando la síntesis de proteínas, y generando efecto citotóxico en células de mamíferos a través de apoptosis; esta condición le permite constituir la porción tóxica de una inmunotoxina. Las inmunotoxinas son moléculas con potencial uso en terapias contra el cáncer debido a que están conformadas por un ligando asociado a tumores y una toxina; esto les permite unirse a receptores específicos en la superficie celular, ser internalizadas vía endocitosis y tener efectos tóxicos para eliminar solo a las células tumorales. El objetivo de este estudio fue construir una inmunotoxina a partir de curcina y un anticuerpo monoclonal contra Her2 mediante oxidación de azúcares y aminación reductiva. Her2 es un antígeno asociado al cáncer con gran potencial para el desarrollo de terapias dirigidas. La curcina aislada de la torta residual de Jatropha curcas L mostró una masa molecular de 32.7 kDa, pI de 8.70 y 4.14% de azúcares. La actividad N-glicosidasa se determinó en ARNr de semillas de Jatropha curcas L, luego de incubación con esta RIP y tratamiento con anilina ácida; la presencia del fragmento Endo confirmó esta actividad enzimática. Los azúcares de curcina fueron oxidados con NaIO4 y los aldehídos generados se aminaron con el anti-Her2 bajo condiciones reductoras. La unión entre ambas proteínas fue comprobada y validada por análisis de inmunodetección. Los efectos citotóxicos fueron evaluados in vitro en las líneas celulares de cáncer de mama SK-BR-3 (Her2+) y MDA-MB-231 (Her2-) y en fibroblastos. Los valores de CI50 para curcina fueron estadísticamente iguales (p<0.05) para los cultivos cancerígenos, con valores de 15.5 + 8.3 y 18.6 + 2.4 µg/mL respectivamente y diferentes respecto a fibroblastos (353.4 + 41.9 µg/mL). Mientras que para la inmunotoxina fueron de 2.2 + 0.08 µg/mL para SK-BR-3, 147.6 + 2.5 µg/mL para MDA-MB-231 y 16.7 + 2.8 µg/mL para fibroblastos. Estos valores demostraron el efecto tóxico diferencial de la inmunotoxina hacia células Her2+ y Her2- (p<0.05). La inmunotoxina fue siete veces más tóxico para la línea SK-BR-3 que la curcina y ocho veces menos tóxica para la línea MDA-MB-231. Estos resultados permiten concluir que la inmunotoxina construida por curcina y un anticuerpo contra Her2 mediante aminación reductiva puede ser un candidato terapeútico contra el receptor Her2. ABSTRACT: Curcin is a ribosome inactivating protein (RIP) that is found in Jatropha curcas seeds, it is an enzyme with N-glycosidase activity over rRNA and thus blocks protein synthesis; it has been shown that curcin has cytotoxic effects on mammalian cells trough apoptosis, for this reason this protein could be part of “immunotoxins”. Immunotoxins are hybrid proteins composed of a tumor-specific ligand linked to a toxin that are used in cancer therapy. These chimeric molecules are attached to specific cell surface receptors and they are internalized by endocytosis, where the toxin affects some metabolic process and kills the tumour cells without affecting healthy cells. This study is focused to investigate if it is possible to build an immunotoxin from curcin and the anti-Her2 monoclonal antibody through sugar oxidation and reductive amination. This antigen is associated with cancer and is a potential target for developing these hybrid molecules. Curcin isolated from seed cake of Jatropha curcas L had a molecular mass of 32.7 kDa, a pI of 8.70 and a total sugar content of 4.14%. N-glycosidase activity was determined using rRNA from seeds of Jatropha curcas L after curcin incubation and aniline acetate treatment; the presence of the Endo fragment confirmed their enzimatic activity. The sugars on curcin were oxidized with NaIO4 and the aldehydes groups were aminated with the anti-Her2 under reducing conditions. The binding between both proteins was tested using SDS-PAGE, immunoblotting and immunocytochemistry. The in vitro cytotoxic effect of curcin and the immunotoxin was assessed on breast cancer cell lines SK-BR-3 (Her2+) and MDA-MB-231 (Her2-) and fibroblasts. IC50 values for curcin were statistically equivalent (p<0.05) for both cancer cultures, with values of 15.5 + 8.3 µg/mL and 18.6 + 2.4 µg/mL respectively, but they were different respect fibroblasts (353.4 + 41.9 µg/mL). While to the immunotoxin was 2.2 + 0.08 µg/mL for SKBR-3, 147.6 + 2.5 µg/mL for MDA-MB-231 and 16.7 + 2.8 µg/mL for fibroblasts. These values showed the differential toxic effect of the immunotoxin to Her2+ and Her2- cells (p<0.05). The immunotoxin was seven times more toxic to the SK-BR-3 than curcin and eight times less toxic to the MDA-MB-231. It was concluded that the immunotoxin composed of curcin and an antibody against Her2 that was constructed by reductive amination could be a therapeutic candidate against Her2+ cancer.