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Estudio clínico, inmunológico y genético de pacientes con defecto en el estallido respiratorio: función de NCF4 y NRAMP1

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dc.contributor.author Nieto Patlán, Alejandro Ulises
dc.date.accessioned 2020-08-08T02:38:48Z
dc.date.available 2020-08-08T02:38:48Z
dc.date.created 2019-09-09
dc.date.issued 2020-08-06
dc.identifier.citation Nieto Patlán, Alejandro Ulises (2019). Estudio clínico, inmunológico y genético de pacientes con defecto en el estallido respiratorio: función de NCF4 y NRAMP1 (Doctorado en Ciencias en Inmunología). Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudio de Posgrado e Investigación, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. México es
dc.identifier.uri http://tesis.ipn.mx/handle/123456789/28430
dc.description Tesis (Doctorado en Ciencias en Inmunología), Instituto Politécnico Nacional, SEPI, ENCB, 2019, 1 archivo PDF, (94 páginas). tesis.ipn.mx es
dc.description.abstract RESUMEN: Las inmuhodeficiencias primarias (PID) son un grupo heterogéneo de enfermedades genética que afectan el desarrollo o fución del sistema inmunológico. El diagnóstico de PID puede realizarse evaluando de manera como la secuenciación de nueva generación (NGS). La NGS consiste en la secuenciación masiva del exoma, genoma o transcriptoma de pacientes. A partir de la utilización de NGS en el 2010, se han descrito más de 100 nuevos genes asociados a un defecto inmunológico. La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es una inmunodeficiencia primaria que afecta el complejo NADPH oxidasa, causando defectos en el estallido respiratorio. Los pacientes con EGC sufren de infecciones invasivas y severas, por lo general son diagnosticados a edades tempranas y a la fecha los tratamientos consisten en profilaxis con antibióticos y antifúngicos, las curas para esta enfermedad son el trasplante de médula ósea y en algunos casos la terapia génica. Se analizó por NGS el exoma completo depacientes con infecciones recurrentes y que no habían sido diagnosticados previamente con alguna inmunodeficiencia primaria, del análisis realizado se encontraron mutaciones en los genes NCF4 y SLC11A1 las cuales fueron caracterizadas en modelos de sobreexpresión utilizando células HEK-293T y células EBV-B. Asimismo, se evaluó la actividad del complejo NADPH oxidasa en neutrófilos de los pacientes utilizando un modelo de retro-transducción viral en células EBV-B de pacientes con deficiencia en p40phox. Se encontraron 24 pacientes con deficiencia en p40phox, los pacientes presentaron siete mutaciones no descritas. Se caracterizaron funcionalmente los alelos demostrando que todos son perdida de función a excepción de los alelos c. 120_134del y p. R58C que son hipomórficos. Al evaluar las células de pacientes se encontró que todas las células evaluadas presentan defecto en la expresión de p40phox a excepción de los pacientes con mutaciones en p. R58C y p. R105Q. Se encontró que el estallido respiratorio inducido por PMA es residual en polimorfonucleares de lospacientes, en donde el efecto era siempre más elevado comparada a las células de pacientes con EGC crlásica. Sin embargo, al utilizar líneas celulares EBV-B de los pacientes, todos mostraron defectos en el estallido respiratorio con PMA. Posteriormente, se realizó el rescate genético de EBV-B de pacientes con deficiencia en p40phox insertando el gen silvestre de p40phox mediante retro-transducción viral. Se encontró que sólo las células rescatadas con p40phox silvestre recuperan la actividad del complejo NADPH oxidasa en este sistema, comprobando así que la ausencia de p40phox es la responsable del defecto el estallido respiratorio. Adicionalmente, utilizando la NGC se encontró el primer paciente con deficiencia en SLC11A1, gen que codifica para la proteína NRAMP1. Se evaluó la actividad de la NADPH oxidasa en polimorfonucleares y monocitos del paciente, se encontró defecto exclusivamente en los polimorfonucleares. Se evaluó la cantidad de RNA mensajero en polimorfonucleares y se observó que no hay diferencia en el nivel de transcritos comparado a controles sanos. Finalmente, se evaluó el alelo mutado p V484M en un modelo de sobreexpresión en células HEK-293T y se encontró que la expresión de NRAMP1 a nivel de proteína se ve disminuida. El uso de la NGS es útil para el diagnóstico genético de pacientes con inmunodeficiencias y permite la descripción de nuevas etiologías genéticas. Con respecto al gen NCF4-p40phox. Se describieron 24 nuevos casos con deficiencia de p40phox y se caracterizaron 7 nuevas mutaciones de p40phox. La deficiencia de p40phox difiere de la EGC al presentar mayor número de infecciones superficiales y mayor desregulación de la respuesta inmune en contraste a las recurrentes infecciones severas e invasivas observadas en EGC. Finalmente, respecto al gen SLC11A1 - NRAMP1 se describió al primer paciente con deficiencia en RAMP1 la cual es célula-específica afectando exclusivamente a los neutrófilos. ABSTRACT: Primary Immunodeficiencies (PID) are genetic diseases that affect the correct function of the immune system. The PIDs are diagnosed evaluating the presence or the function of the immune cells and more recently using molecular techniques such as next-generation sequencing (NGS). The NGS consists in the massive sequencing of the genome, exome or transcriptome of patients. Since the implementation of NGS as a diagnostic method, more than 100 genes have been described conferring PID. Chronic granulomatous disease (CGD) is a PID characterized by defects in the NADPH oxidase complex affecting the oxidative burst in patient's cells. Patients with CGD suffer life-threatening invasive infections, they have an early onset and are diagnosed early in life. The only curative treatment is the Human Stem Cell Transplantation. We used NGS to analyze the whole exome sequence patients with recurrent infections that haven't been diagnosed previously. Subsequent WES data analysis lead to the discover of bi-allelic mutations in genes NCF4 and SLC11A1. Mutations were further characterized in overexpression system using HEK-293 cells and EBV-B cells. Moreover, we evaluated the oxidative burst in patient's polymorphonuclears stimulated with PMA using the DHR method. Finally, we performed the genetic rescue by viral retro-transducción in EBV-B cells from patients with p40phox deficiency. We found twenty-four patients with p40phox-deficiency. Patients carried seven novel mutations in NCF4. Molecular characterization of the alleles showed six of them were Loss of Function whereas only two were hypomorphic (c. 120_134del and p. R58C). All the mutated alleleslead to a severe defect in the expression of p40phox protein except in the alleles with missense mutations (p. R58C and p. R105Q). Afterwards, we evaluated the activity of the NADPH oxidase complex. The oxidative burst in polymorphonuclears induced by PMA was from residual to normal but in all cases higher compare as the cells from classic CGD. By contrast, when using the EBV-B cell lines from the patients, all patient's EVB-B cells showed a severe defect in the oxidative burst after PMA stimulation. Finally, we performed the genetic rescue in EBV-B cells from p40phox deficient patients, we found that only when cells were reconstituted with the p40phox wild-type and stimulated with PMA the cellular defect is recued. These results confirm that the absence of a functional p40phox protein is the cause of the severe defects in the NADPH oxidase activity. Additionally, using NGC we found the first case of NRAMP1 deficiency. Homozygous mutation in SLC11A1 was found in another patient. We tested the oxidative burst in polymorphonuclears and monocytes. Interestingly, NRAMP1 deficienct cells showed impair oxidative burst exclusively in neutrophils compare as monocytes. We found SLC11A1 mutation p.V484M does not affect the level of mRNA transcripts but it impairs the protein expression using an overexpression system in HEK293 cells. NGS techniques are useful for the diagnostic of PID patients and allows the discover of new genetic etiologies. Regarding NCF-p40phox. We found the largest cohort of p40phox deficient patients. We found seven novel genetic etiologies of p40phox deficiency. Finally, p40phox deficiency differs from classic CGD. p40phox deficient patients showed a milder clinical phenotype characterized by superficial infections and immune dysregulations. On regard with SLC11A1-NRAMP1 we reported the first patient with NRAMP1 deficiency associated to susceptibility of infections. This deficiency is suggested to be cell-dependent affecting exclusively the neutrophils. es
dc.description.sponsorship SIP-IPN es
dc.language.iso es es
dc.subject Enfermedad granulomatosa crónica es
dc.subject NCF4 es
dc.subject NRAMP1 es
dc.title Estudio clínico, inmunológico y genético de pacientes con defecto en el estallido respiratorio: función de NCF4 y NRAMP1 es
dc.contributor.advisor Serafín López, Jeanet
dc.contributor.advisor Bustamante, Jacinta Cecilia


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