Desarrollo de un método cuantitativo para la detección del polímero de insulina en plasma de pacientes obesos como posible marcador de prediabetes

Abstract

RESUMEN: Introducción: Se ha demostrado que la insulina puede sufrir modificaciones en su estructura al interaccionar con especies reactivas (ER) generando su polimerización y pérdida de su función hipoglucemiante. El desarrollo de hiperglucemia a una concentración de 100 a 125 mg/dL en presencia de una hiperinsulinemia se conoce como un estado de resistencia a la insulina o prediabético. Uno de los principales factores de riesgo para la prediabetes es la obesidad, ya que la acumulación excesiva de tejido adiposo se asocia a una elevada producción de ER. Actualmente se ha reportado que las ER Interaccionan con la insulina generando su polimerización y pérdida de su función. Objetivo: desarrollar un método sensible y cuantitativo por la técnica de IPCR para la detección de polímeros de insulina en plasma de pacientes obesos. Material y métodos: se incluyeron 43 pacientes obesos. Tres muestras de pacientes fueron empleadas para la obtención de polímero de insulina: Insulina Recombinante Humana (IRH) fue incubada en estas sangres. El polímero obtenido se purificó y fue utilizado como antígeno para inocular ratones Balb/c. La generación de anticuerpos contra polímero de insulina fue monitoreada por western blot. El bazo del ratón positivo a anticuerpos fue aislado para obtener linfocitos B y ser fusionados con células de mieloma (Ag8) para la obtención de hibridomas. Los hibridomas fueron crecidos y seleccionados por dilución. El anticuerpo monoclonal fue obtenido del medio de cultivo de hibridomas y purificados por columna de proteína A agarosa. El anticuerpo monoclonal contra polímero de insulina y el ADN fueron biotinilados. IPCR fue realizada tipo ELISA fijando el anticuerpo de captura en la base del pozo, posteriormente se agregó el polímero de insulina o plasma de paciente y finalmente el anticuerpo biotinilado más estreptavidina y el ADN biotinilado. La amplificación se realizó a través de la técnica de PCR en tiempo real usando SYBR Green como fluoróforo. Resultados: Se generó un banco de 40 plasmas de pacientes obesos (20 con y 20 sin capacidad de polimerizar insulina), listos para determinar niveles de polímero de insulina. Se obtuvieron clonas (hibridomas) productoras de anticuerpo contra polímeros de insulina (anticuerpo empleado en IPCR). Se estableció el método de IPCR usando polímero de insulina y su detección, obteniendo como límite de detección 40 ng/μL de polímero de insulina. Conclusión: Se generó todo lo necesario para la obtención de la técnica de IPCR, se desarrolló el método obteniendo un límite de detección 40 ng/μL, sin embargo, es necesaria la validación empleando suero de pacientes del banco generado. ABSTRACT: Introduction: It has been demonstrated that insulin can undergo modifications in its structure by to interact with reactive species (RE) generating its polymerization and loss of its hypoglycemic functionality. The hyperglycemia development at a concentration of 100 to 125 mg/dL in the presence of hyperinsulinemia is known as a state of insulin resistance or prediabetes. One of the main risk factors for diabetes is obesity, due to the excessive accumulation of adipose tissue is associated with high RE production. Currently, it has been reported that RE interacts with insulin generating its polymerization and loss of its function. Aim: Develop a sensitive and quantitative method by the IPCR technique for the insulin polymers detection in plasma of obese patients. Material and methods: It was included forty three obese patients. Three samples of patient were used to obtain insulin polymer: Recombinant Human Insulin (RHI) was incubated in these blood. The polymer obtained was purified and it was used as antigen to inoculate Balb/c mice. The antibody generation against insulin polymer was monitored by western blot. The spleen from positive mouse to antibody was isolated to obtain B lymphocytes and to be fused with myeloma cells (Ag8) to obtain hybridomas. The hybridomas were grown and selected by dilution. The monoclonal antibody was obtained from the culture medium of hybridomas and purified by a column of protein A agarose. The monoclonal antibody against insulin polymer and DNA were biotinylated. IPCR was performed ELISA type fixing the capture antibody at the base of the well, then it was added the insulin polymer or patient's plasma and finally the biotinylated antibody plus streptavidin and biotinylated DNA. The amplification was carried out through the real-time PCR technique using SYBR Green as a fluorophore. Results: It was generated a bank of 40 plasma from obese patients (20 with and 20 without the ability to polymerize insulin), ready to determine insulin polymer levels. It was obtained clones (hybridomas) producers of antibodies against insulin polymers (antibody used in IPCR). It was stablished the IPCR method using insulin polymers and its detection, obtaining as limit of detection 40 ng μL of insulin polymer. Conclusion: It was generated all the necessary to the obtention of the IPCR technique, it was developed the method obtaining a detection limit of 40 ng/μL, however, it is necessary the validation using patient's serum from the bank generated.