Evaluación in silico e in vitro del efecto de yessotoxina y del N-(2´- hidroxifenil)-2-propilpentanamida en la inhibición de la proliferación de las células de cáncer de mama como moduladores del canal de sodio regulado por voltaje NaV1.5

Abstract

RESUMEN: El cáncer mama es una de las principales causas de muerte en el mundo; esta enfermedad se relaciona con diferentes vías de señalización e involucra distintos receptores, entre los que se encuentran los canales de sodio regulados por voltaje (NaV), los cuales se relacionan con la metástasis celular en el cáncer de mama. Algunos fármacos antiepilépticos y toxinas de origen marino se han considerado como posibles alternativas terapéuticas porque presentan una variedad de mecanismos de acción capaces de modificar diversas vías intracelulares de señalización. Por esta razón, es importante estudiar nuevas moléculas como opciones terapéuticas. El objetivo de este estudio fue evaluar in silico la afinidad de la yessotoxina (YTX) y del N-(2´-hidroxifenil)-2-propilpentanamida (HO-AAVPA) en el canal NaV1.5, y en ensayos in vitro la capacidad antiproliferativa en células de cáncer de mama. Los estudios in silico permitieron analizar las interacciones y las energías libres de unión con YTX y el HO-AAVPA sobre el canal NaV1.5. Se realizó la síntesis química del HO-AAVPA, y su estructura y pureza se comprobaron por técnicas espectroscópicas (UV-Vis, 1H RMN y 13C RMN). Además, se realizaron ensayos in vitro con la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y una línea celular sana testigo, NIH-3T3, para evaluar la actividad antiproliferativa de ambos compuestos. Los resultados obtenidos de la simulación in silico mostraron que existen interacciones y valores energéticamente favorables para la afinidad de ambos compuestos con la proteína. Se encontró que la YTX tiene afinidad por los aminoácidos de segmentos del Dominio I y II, y que el HO-AAVPA tiene afinidad por los segmentos 5 y 6 que forman parte del poro del canal. Durante la síntesis química del HO-AAVPA se encontraron diferencias en el porcentaje de rendimiento total, pero la caracterización del compuesto indicó que su pureza fue superior al 99.9%. Los resultados de los ensayos biológicos mostraron que las concentraciones seleccionadas en la ventana terapéutica de ambos compuestos no causan efectos citotóxicos en las células control NIH-3T3; por otra parte, los compuestos exhibieron efectos diferentes: el HO-AAVPA mostró una IC50=208.3 μM en la línea MCF-7 y la YTX un efecto que modifica la morfología celular que favorece el desprendimiento de las células a una concentración de 100 nM. Nuestros estudios, principalmente las simulaciones in silico, son la primera aproximación en la que se considera a las dos moléculas con potencial de afinidad por los canales de sodio regulados por voltaje NaV1.5. Esta investigación contribuye al conocimiento de los dos ligandos, y se sugiere continuar con su análisis para comprender el mecanismo de acción sobre esta proteína, la cual es considerada un blanco terapéutico relacionado con el desarrollo del cáncer. En conclusión, el acoplamiento molecular de la YTX y el HOAAVPA presentan diferentes energías de unión que favorecen la afinidad con el NaV1.5. El complemento de los dos ensayos permitió observar el desprendimiento de las células y los cambios morfológicos que éstas presentaron a la exposición de los compuestos. ABSTRACT: Breast cancer is one of the leading causes of death in the world. This disease is related to different signaling pathways and different cell receptors, among which are the voltage-gated ion channel (NaV), which are proteins related to cellular metastasis in breast cancer. Various antiepileptic drugs and marine-origin toxins have been identified as possible therapeutic alternatives given the variety of action mechanisms that are able to modify a large array of intracellular signaling pathways. For this reason, it is important to study new molecules as possible therapeutic alternatives. The study aimed to evaluate the affinity of yessotoxin (YTX) and N-(2´- hydroxyphenyl)-2-propylpentanamide (HO-AAVPA) to channel NaV1.5 using in silico analysis, and in vitro assays to evaluate their antiproliferative capacity in breast cancer cells. In silico simulations on voltage-gated sodium channels NaV1.5 were performed to analyze their interactions and free union energies with YTX and HO-AAVPA. Chemical synthesis of HO-AAVPA was carried out, and its structure and purity were verified by spectrometric techniques (UV-Vis, 1H NMR, and 13C NMR). Additionally, in vitro assays on a breast cancer cell line (MCF-7) and a murine model cell line (NIH-3T3) were performed to evaluate the antiproliferative activity of the abovementioned compounds. Results from the in silico simulation showed interactions and energetically favorable energy values on the affinity of both compounds on the target protein. Affinity of YTX on residues from segments of Domain I and II was noted, as the affinity of HO-AAVPA for segment 5 and 6 that are part of the channel pore. Differences in total percentage of efficiency during HO-AAVPA chemical synthesis were found, however, compound characterization indicated its purity above 99.9%. Results from the biological assays indicated that the selected concentrations for the therapeutic windows have no cytotoxic effect in the control cell line NIH-3T3; on the other hand, both compounds exhibited different effects; for instance, HO-AAVPA showed an inhibitory effect at 208.3 μM on MCF-7 and YTX changed cell morphology favoring cell detachment, at 100 nM. This study, mainly in silico simulations, is the first approach with two molecules to assess their potential affinity on the voltage gated sodium channel NaV1.5. Moreover, it contributes to an increase in the knowledge of the two ligands. We suggest to continue their investigation for a better understanding of the mechanisms of action on the voltage-gated sodium channel isoform NaV1.5, which is considered an important therapeutic target related to cancer development. In conclusion, molecular dockings of YTX and HO-AAVPA showed different free union energies that favor affinity on the NaV1.5. The two selected assays allowed us to observe detachment of the cells and morphological changes when exposed to the compounds.