RESUMEN: La eNT es una metaloenzima que tiene como cofactor a los iones de Zn+2, se caracteriza por su unión a las membranas biológicas mediante residuos de glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), no hidroliza sustratos como βglicerol-fosfato (β−GP) ni al p-nitrofenil-fosfato (p-NPP), presenta una masa molecular aparente monomerizada de entre 60-80 KDa, y es inhibida fuertemente por el α, β-metilenadenosina 5’ difosfato (α, β -MADP). Esta enzima presenta una variedad de funciones dependiendo del tejido y organismo donde se exprese, sin embargo, su actividad enzimática sobre AMP produce adenosina y fosfato inorgánico (Pi). Se presume que la eNT representa la mayoría de las enzimas responsables de la formación extracelular de nucleósidos a partir de nucleósidos 5’- monofosfatos. Así, la eNT juega un papel importante en la producción de adenosina a partir del AMP extracelular y por tanto la adenosina participa en la subsecuente activación de los receptores de adenosina P1. La adenosina y los nucleótidos de adenina (ATP, ADP, AMP) tienen actividad neuromoduladora, sobre receptores purinergicos de clase P1 y P2 respectivamente.
Posteriormente se encontró que los neurotransmisores ATP y GABA, se coliberan en neuronas en cultivo (Jo and Schlichter, 1999). La coliberación de ATP, GABA y 5’-nucleotidasa soluble ha sido descrita en el ducto deferente, que es inervado por el sistema purinérgico (Todorov et al, 1997). Nuestro interés es describir el grado de participación de la eNT en la degradación de los nucleótidos lliberados en sinápsis periféricas, específicamente en el ducto deferente, para ello se pretende clonar parte de la eNT expresda en el ducto deferente de la rata. A continuación se presentan los resultados obtenidos en este trabajo. Se purificó la eNT mediante cromatografía de afinidad en Con-A-Sepharose y AMP-Agarose, esta proteína presentó las caracteristicas de la eNT: una actividad AMPasa de 600 nmoles de Pi hora-1, al ser incubada con; AMP, pnitro-fenilfosfato, β-glicerolfosfato ó el inhibidor α, β metilen adenosina 5’- difosfato, presentó las caracteristicas de actividad e inhibición indican que la enzima purificada corresponde a eNT del ducto deferente de la rata, pues el sustrato preferido es AMP, es inhibida por α, β-MADP y no hidroliza ni al p-NPP ni al β-GP. Mediante SDS-PAGE, se detectó una proteína cuyo peso molecular aproximado es de 66 KDa, lo cual corresponde al rango de peso molecular de eNT. Además, se clonó un amplicón de aproximadamente 1200 pb a partir del RNA extraído del ducto deferente de la rata, el cual se encuentra integrado al vector de clonación pCR 2.1-TOPO, mismo que se ubica en las células transformadas de E. coli DH5α almacenadas a -700 C.
ABSTRACT: Ecto 5’-nucleoidase (eNT) is a metalloenzyme containing Zn as a cofactor, it is known that eNT is expressed in all plasma membranes, where it attaches to it by a glycosil-phosphatidil-insoitol (GPI) moiety, the molecular mass of the monomer is around 60-80 kDa, it prefers AMP over other nucleotides, does not hydrolyze β-glicerolphosphate (β-GP), nor paranitrophenylphosphate (p-NPP), and it is inhibited specifically by α,β-metyleneADP (MADP). When incubated with AMP eNT produces adenosine and inorganic phosphate (Pi). It has been assumed that eNT is responsible for the hydrolysis of extracellular nucleotides, producing adenosine, which in turn is a neuromodulator through metabotropic purinergic receptors (P2Y). In vas deferens it has been shown that ATP is a fast action neurotransmitter trough ionotropic receptors (P2X). There is evidence for a synaptic release of an enzyme that degrade ATP after it is released in the end plate of the muscle of vas deferens, but the nature of this enzyme has not been conclusively demonstrated. As a first step to characterize the enzyme responsible for the hydrolysis of synaptic release of ATP in vas deferens, we started to characterize the main enzyme that hydrolyze AMP (AMPase) of this tissue, that up to known of authors has not previously aborded. eNT was purified form dissected vas deferns. After extracting the tissue a first homogenization was done and after differential centrifugation a supernatant (S2) containing the highest AMPase was subjected to affinity chromatography, by using concanavaline-A-Sepharose (ConA-Seph) and then to AMP-Agarose, after this last step, the enzyme was desalting. The final activity showed a value of 600 nmol Pi produced h-1. The protein analysis showed a single protein band of 66 kDa, and the AMPase activity was inhibited by MADP, but p-NPP, β-GP, were both not hydrolyzed, besides, Zinc was shown to be present in the purified protein. All these characteristics belong to eNT enzyme. The molecular cloning of the eNT from vas deferens tissue was started, an amplicon of 1200 bp was obtained and inserted into a pCR2.1-TOPO vector.
