Caracterización parcial de bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas aisladas de hortalizas

Abstract

ABSTRACT: LAB have been used for the production of fermented foods, were described by Louis Pasteur as microorganisms of sour milk. Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Carnobacterium, Aerococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Oenococcus and Weissella are the main genus that belong to this group of organisms, which have been isolated from a large number of sourses, and have been consided as cosmopolitan. Probiotics are defined as living organisms, mainly bacteria, used as nutritional supplements, after being ingested in sufficient quantities, could improve the microbial balance in the intestine of the host causing a positive impact on their health. A feature of probiotics is the ability to produce bacteriocins, ribosomal protein synthesis which have the particularity to inhibit other bacteria, including some pathogens. In recent years it has sought, identified and characterized a large number of bacteriocins produced by BAL, used as probiotic bacteria in foods or during fermentation in the food industry, which has caused great interest. The aim of this paper is partially characterize bacteriocins produced by BAL isolated from horticultural products. It worked with 20 samples of vegetables: artichokes, broccoli, Brussels sprouts and cauliflower. It followed the methodology for isolation described by Teixeira et al., 2006. dilutions of the liquid washing were inoculated in APN and incubated at 30 °C/48 hours in CO2 atmosphere. Supernatants of BAL strains were tested to detect the presence of bacteriocin-like substances against reference strains, the isolates that presented inhibitory activity, were identified by API 50 CHL system and by molecular methods, amplifying the 16S rRNA gene. Is proved in the BAL supernatants isolated at different pHs, temperatures, and proteases adhesion assays were conducted in the cell line HEp-2 supernatant is then concentrated by lyophilization and fractionated by ultrafiltration to estimate the molecular size, confirming the result by Tricine SDSPAGE bands and embedded in agar on a lawn of the reference strain. In the present study found that 75% of samples were positive for the isolation of BAL. Only 11 strains showed inhibition on Salmonella Typhi., Listeria monocytogenes, L. innocua and S. aureus, these organisms were used because literature suggests that pathogens are found in vegetables and fruits, such as Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157: H7, S. aureus. The BAL genotypes were identified as: Pediococcus acidilactici, Weissella cibaria, Weissella sp. Leuconostoc mesenteroides and Enterococcus faecalis. The adherence phenotype is present in 91% of the strains tested. At termostability testing all the supernatants were active after treatment of 121 °C for one hour, indicating that the molecules responsible are thermostable. Of the genera Pediococcus, Enteroccocus, Weissella, were active at pHs of 2 to 8 and Leuconostoc 2 to 7. The effect of proteases on the supernatants obtained showed that all were resistant to trypsin but sensitive to other proteases tested. The amount of protein concentrates of the supernatant of Weissella spp. (strain 9), was measured by the Bradford method and found that the relative molecular mass was between 3 to 9 kDa. Parallel gel was run in another Tricine-SDS PAGE were imbibed on agar containing a lawn of reference strains previously tested and found inhibition in the three fractions embedded. The production of bacteriocins by the BAL, is important both scientifically and economically because the producing strains are candidates to have biotechnological applications, however it is necessary to further study of this function to find the most appropriate technological and ideal conditions for its production and specific uses.

RESUMEN: Las BAL se han empleado para la elaboración de alimentos fermentados, fueron descritas por Louis Pasteur como “organismos de la leche agria”. Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Carnobacterium, Aerococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Oenococcus y Weissella son los principales géneros que pertenecen a este grupo de microorganismos, los cuales se han aislado de una gran cantidad de ambientes por lo que se han llegado a considerar cosmopolitas. Los probióticos se han definido como organismos vivos, principalmente bacterias, usados en forma de suplementos nutricionales que, tras ser ingeridos en cantidades suficientes, pueden mejorar el equilibrio microbiano en el intestino del hospedero provocando efectos favorables sobre su salud. Una característica de los probióticos es la capacidad de producir bacteriocinas, proteínas de síntesis ribosomal que tienen la particularidad de inhibir a otras bacterias, entre ellas a algunos patógenos. En los últimos años se ha buscado, identificado y caracterizado un gran número de bacteriocinas producidas por BAL, utilizadas como bacterias probióticas en los alimentos o durante la fermentación en la industria de los alimentos, lo que ha originado gran interés. El objetivo de este trabajo es caracterizar parcialmente las bacteriocinas producidas por BAL aisladas de productos hortícolas. Se trabajaron 20 muestras de hortalizas que fueron: alcachofa, brócoli, col de Bruselas y coliflor. Se siguió la metodología para su aislamiento descrita por Teixeira et al., 2006. Se sembraron en APN diluciones del liquido de lavado y se incubó a 30°C/48 horas en atmósfera parcial de CO2. Se probaron los sobrenadantes de las cepas de BAL para evidenciar la presencia de sustancias tipo bacteriocinas contra cepas de referencia, posteriormente los aislamientos que presentaron actividad inhibitoria, se identificaron mediante el sistema API 50 CHL y se identificaron molecularmente amplificando el gen 16S rRNA. Se probaron sobrenadantes de las BAL aisladas a diferentes pHs, temperaturas, y proteasas Se hicieron ensayos de adherencia en la línea celular HEp-2 Posteriormente se concentró el sobrenadante por liofilización y se fraccionó por ultrafiltración para estimar la talla molecular, confirmando el resultado mediante Tricina-SDS PAGE y se embebieron las bandas en agar sobre un césped de la cepa de referencia. En el presente trabajo se encontró que el 75% de las muestras fueron positivas para el aislamiento de BAL. Sólo 11 cepas presentaron inhibición sobre Salmonella Typhi., Listeria monocytogenes, L. innocua y S. aureus estos microorganismos fueron utilizados ya que literatura indica que son patógenos encontrados en hortalizas y frutas, como es el caso de Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, S. aureus. Las BAL identificadas genotípicamente fueron: Pediococcus acidilactici, Weissella cibaria, Weissella sp. Leuconostoc mesenteroides y Enterococcus faecalis. La adherencia se presentó en el 91% de las cepas probadas. Las pruebas de termoestabilidad todas los sobrenadantes tuvieron actividad, después de un tratamiento de 121°C por una hora, lo que indica que las moléculas responsables son termoestables. De los géneros Pediococcus, Enteroccocus, Weissella, tuvieron actividad a pHs de 2 a 8 y Leuconostoc de 2 a 7. El efecto de las proteasas sobre los sobrenadantes obtenidos mostró que todas fueron resistentes a la tripsina pero sensibles a las demás proteasas probadas. La cantidad de proteínas de los concentrados del sobrenadante de Weissella sp. (cepa 9), se midió por el método de Bradford encontrándo que la masa molecular relativa fue de 3 a 9 kDa. Paralelamente se corrió otro gel de Tricina-SDS PAGE se embebieron en agar conteniendo un césped de las cepas de referencia probadas anteriormente, encontrando inhibición en las tres fracciones embebidas. La producción de substancias tipo bacteriocinas por parte de las BAL, tiene gran importancia tanto científica como económica debido a que las cepas productoras son candidatas a tener aplicaciones biotecnológicas, sin embargo es necesario hacer estudios más profundos de estas para encontrar la función tecnológica más adecuada y las condiciones ideales para su producción, y usos específicos.