RESUMEN: El Cáncer es una enfermedad que se caracteriza por una proliferación celular descontrolada con altos índices de mortalidad y es un problema importante de salud a nivel mundial. En México fue la segunda causa de muerte en el 2010. Debido a la importancia de la enfermedad, actualmente existen quimioterapias enfocadas a la eliminación de células tumorales. Nuestro grupo de investigación ha realizado la búsqueda sistemática de agentes antitumorales de origen natural, que presenten actividad citotóxica con mayor eficacia en líneas celulares de origen tumoral y probablemente con menores efectos secundarios. Derivado del conocimiento de que plantas como Calendula officinalis han sido utilizadas de manera tradicional para el tratamiento de algunos padecimientos, entre ellos se considera su posible efecto antitumoral. En búsqueda de nuevos principios activos antitumorales se decidió evaluar un probable efecto inhibidor de la proliferación en el extracto hidroalcohólico de Caléndula sobre dos líneas celulares: la línea celular A549 de adenocarcinoma de pulmón y la línea MRC-5 de pulmón normal inmortalizado. Para determinar cambios en la viabilidad se realizaron ensayos de MTT en ambas líneas, los resultados indican que el extracto de Caléndula por sí solo, induce un incremento de la viabilidad del 40% sobre la línea A549 y la viabilidad no cambia en la línea MRC-5. En los ensayos de proliferación mediante la identificación de un marcador nuclear que se sintetiza en la fase de G1 y S del ciclo celular, la proteína PCNA, los resultados mostraron que en la línea A549 el extracto induce proliferación celular. Así mismo se realizó la técnica de Anexina V, se observó que el extracto por sí solo no induce apoptosis. Consecutivamente se realizaron experimentos para observar si el efecto del extracto hidroalcohólico de Calendula officinalis coopera o interfiere con el efecto de un fármaco antitumoral de elección en cáncer de pulmón, como lo es Taxol. Los resultados mostraron que al realizar los experimentos empleando la mezcla del extracto de Caléndula + Taxol al mismo tiempo, los efectos citotóxicos son más eficientes que al usar el Taxol por sí solo y los resultados pueden observarse a tiempos más cortos (3-6 h). Además el tratamiento es capaz de inducir apoptosis en las células A549 de origen tumoral, pero no en la línea MRC-5. En conclusión mientras el extracto de Caléndula por sí solo, induce un incremento en la proliferación celular, combinado con el antitumoral Taxol sorprendentemente induce citotoxicidad y se potencia el efecto de inducción de la apoptosis. La presencia de flavonoides con actividad antioxidante y pro-oxidante, contenidos en el extracto hidroalcohólico puede ser el principio que explique este resultado. Por otra parte al evaluar una probable alteración de la proliferación usando inhibidores del canal KCNMA1 se observó que los ensayos de viabilidad realizados en ambas líneas celulares, en presencia del inhibidor específico del canal KCNMA1 (Caribdotoxina), no mostraron cambios significativos que sugieran una modulación de la viabilidad atribuible al canal.
ABSTRACT: Cancer is a disease characterized by uncontrolled cellular growth with high mortality rates and it is an important health problem around the world. In Mexico is considered the second cause of death. Therefore, currently there are several strategies based in chemotherapy, aimed to eliminating the tumor cells. Our research group has conducted a systematic discovery search for anticancer agents of natural origin showing cytotoxic activity on tumor cells, and probably they would be more effective diminishing side effects. Previous knowledge stating that plants such as Calendula officinalis have been used traditionally for the treatment of several diseases, we found that Calendula is considered to have antitumor effects. In search for innovative antitumor activities, we decided to search for a probable growth inhibition of Calendula hydroalcoholic extract on two cell lines: A549 from small cells lung adenocarcinoma and MRC-5 a non tumoral but immortalized pulmonary cell line. In order to determine changes in viability, MTT assays were performed, our results indicate that the Calendula extract alone, induces an increase of 40% viability on the A549 cells and does not induce changes in viability assays using MRC-5 cells. Proliferation assays were performed through the identification of a nuclear marker the protein PCNA, synthesized during cell cycle stages from G1 to S. PCNA detection results showed that the extract induces cell proliferation on A549. Also, Annexin V assays were performed and hydroalcoholic extract Calendula alone did not induce apoptosis. Besides, Calendula and Taxol were tested together in order to determine whether the combined treatment would cooperate or interfere with the basal cytotoxic effect of this antitumor drug (of choice in lung cancer). Results from combined treatments showed that the cytotoxic effect turns out to be more efficient than when using Taxol alone and cell changes are observed sooner (after 3-6 h of treatment). In addition, combined treatment induces apoptosis in A549 cells derived from cancer, while in the immortalized but non transformed lung cell line MRC-5, not any effect was observed. The above experimental work allows us to conclude that while the extract of Calendula alone induced cell proliferation and not apoptosis, the combined treatment with Taxol, surprisingly induces cytotoxic and apoptotic effect, differentially in A549 cells from tumor origin. Perhaps the Calendula hydroalcoholic extract`s content of flavonoids with antioxidant and pro-oxidant activity have something to do with the enhancement of cytotoxicity and apoptosis observed in our experiments. In the other hand the viability assays performed in both cell lines, using the channel-specific inhibitor KCNMA1 (charybdotoxin) showed no significant changes, suggesting that there is no modulation of cell proliferation after treatments using the KCNMA1 channel inhibitor.
