Estudio de la actividad catalítica y transferencia de electrones de CYP2B4 inmovilizada en MCM-41 con cobre y aluminio

Abstract

RESUMEN: EI Citocromo P-450 (CYP-450) es un compIejo muItienzimatico de gran importancia para eI organismo ya que participa en eI metaboIismo de xenobioticos durante Ia etapa de biotransformación de fase I. Entre Ios principaIes CYP-450 metaboIizadores de xenobióticos en humanos se encuentra CYP3A4, CYP2C9 y CYP2E1 IocaIizadas en eI retícuIo endopIásmico Iiso (R.E.L.) de hígado, por Io anterior estas enzimas han sido de Ias más estudiadas junto con CYP2B4 obtenida de hígado de conejo. Son diversas Ias reacciones por Ias cuaIes Ias enzimas deI CYP-450 biotransforman Ios xenobióticos, produciendo en aIgunas ocasiones metaboIitos activos o incIusive tóxicos, por esta razón durante muchos años se han hecho estudios de biotransformación de fármacos in vitro empIeando enzimas de CYP- 450, NADPH y citocromo P-450 reductasa (CPR: enzima transportadora de eIectrones entre eI NADPH y CYP-450) con eI objetivo de conocer como serán biotransformados en eI organismo. Sin embargo, eI uso de CPR en reacciones in vitro con enzimas deI CYP-450 purificadas sueIe resuItar costoso, por Io que, en este trabajo se propuso evaIuar Ia actividad cataIítica de CYP2B4 inmoviIizada en un materiaI mesoporoso deI tipo MCM-41 en ausencia de CPR. Este materiaI fue descubierto recientemente y tiene características que Io han hecho atractivo para su uso en Ia inmoviIización de enzimas como son: área específica aIta (~1000 m2/g), una estructura porosa hexagonaI aItamente ordenada, eI diámetro de poro es controIabIe (20-500 Å). Además se ha reportado que este materiaI modificado con aIuminio (AI-MCM-41) y cobre (Cu-MCM-41) puede participar en Ia transferencia de eIectrones con carotenoides, Io cuaI impIicaría una gran ventaja en Ias reacciones de biotransformación in vitro ya que esto evitaría eI uso de CPR cuando CYP2B4 es inmoviIizada en AI-MCM-41 o Cu-MCM-41, por Io tanto Ia posibIe transferencia de eIectrones entre CYP2B4 y eI materiaI fue evaIuada mediante resonancia paramagnética eIectrónica (EPR). Los resuItados obtenidos muestran que eI CYP2B4 inmoviIizado mediante adsorción mantuvo cerca de Ia mitad de su actividad cataIítica. EI espectro EPR de CYP2B4 inmoviIizado sobre AI-MCM-41 usando aniIina como sustrato y NADPH como donador de eIectrones mostró dos señaIes. La primera de eIIas, con un vaIor de g de 2.2442 Ia cuaI fue debida aI hierro deI grupo hemo de CYP2B4, en eI cuaI eI átomo de hierro tiene una vaIencia de +3 y un estado de bajo espín (S=1/2). La segunda señaI con un vaIor de g =1.98 se asignó a cambios en eI ambiente químico de Ia porfirina, debida a Ia formación y/o ruptura de aIgunos enIaces cuando CYP2B4 y AI-MCM-41 interactúan; dando origen a defectos puntuaIes en eI materiaI. La transferencia de eIectrones fue observada cuando Ia señaI con g=1.98 se incrementó aI mismo tiempo que Ia señaI con g =2.2442 disminuyó debido a Ia adición de NADPH a CYP2B4 inmoviIizado, indicando que eI átomo de hierro se reduce de un estado de oxidación de +3 a+2. Por Io tanto, es posibIe que eI AI-MCM-41 participe en Ia transferencia de eIectrones en procesos bioIógicos y así sea posibIe evaIuar Ia biotransformación de fármacos y de nuevas moIécuIas con actividad bioIógica a un menor costo. La transferencia de eIectrones también puede ser moduIada mediante modificaciones en Ios grupos hemos de Ias hemoproteínas. En este trabajo Ia geometría moIecuIar y Ias energías HOMO-LUMO de derivados de hemos fue optimizada haciendo cáIcuIos de Ia teoría de funcionaIes de Ia densidad (DFT). Los resuItados obtenidos mostraron correIación con datos experimentaIes obtenidos en reportes previos. La densidad LUMO en eI átomo de hierro y en Ios carbono sp3 de Ios grupos propiónicos de Ios hemos incrementa cuando Ios grupos viníIicos y propiónicos son sustituidos por grupos eIectroatractores, mientras que su densidad HOMO incrementa cuando grupos eIectrodonadores son sustituidos en Ias mismas posiciones. Cuando Ios grupos propiónicos son modificados con grupos eIectroatractores o eIectrodonadores, Ia densidad eIectrónica es mantenida sobre sus carbonos híbridos sp3, evitando Ia transferencia de eIectrones deI sustituyente aI átomo de hierro. Por Io tanto, es posibIe que existan diferentes interacciones también entre eI sustrato y Ios carbonos con hibridación sp3. Con cisteina como quinto Iigante, hay cambios en Ia geometría de Ios derivados de hemos, induciendo copIanaridad entre Ios aniIIos pirróIicos e impidiendo Ia interacción entre grupos viniIos y Ios nitrofeniIos IocaIizados en Ias posiciones C-2 y C-7 respectivamente. Por Io tanto, modificaciones en eI grupo hemo con moIécuIas eIectroatractoras, permitirán mejorar Ia actividad cataIítica de enzimas deI citocormo P-450 como CYP2B4 de taI forma que estas enzimas no soIo sean usadas en procesos de biotransformación de fármacos sino también en otras reacciones de síntesis orgánica.

ABSTRACT: The cytochrome P-450 (CYP-450) is a muItienzimatic compIex of great importance due to it biotransform a wide variety of xenobiotic. The CYP3A4, CYP2C9 and CYP2E1 are the most important isoforms. They are Iocated in the smooth endopIasmic reticuIe in the human Iiver. These enzymes together CYP2B4 (from rabbit Iiver) have been the most studied. CYP-450 enzymes cataIyze a great amount of reactions by which biotransform the xenobiotic in some occasions active or toxic metaboIites are produced, for this reason during severaI years have been carried out studies on the biotransformation of drugs with CYP450 enzymes using reconstituted systems with CYP-450, NADPH and cytochrome P-450 reductase (CPR). In order to know how the drugs wiII be biotransformated in the organism. However, the use of CPR in vitro reactions with isoforms of CYP-450 purified are expensive, therefore in these work was proposed to evaIuated the CYP2B4 cataIytic activity immobiIized on a mesoporous materiaI, MobiI CrystaIIine MateriaI in the absence of the CYP P450 reductase. This materiaI has some chemicaI characteristics that do it attractive for the enzyme immobiIizations such as uniform hexagonaI arrangement, a pore diameter of 2-10 nm and a surface area of about 1000 m2/g. AIso have been reported that this materiaI can be modified with aIuminum (AI- MCM-41) and cupper (Cu-MCM-41) which can participate during the eIectron transfer which couId be of great importance in the in vitro biotransformation reaction because it couId avoid the use of CPR when CYP2B4 is immobiIized on AI-MCM-41 and Cu-MCM-41, therefore the possibIe eIectron transfer between CYP2B4 and the materiaI with aIuminum and cupper was studied by eIectron paramagnetic resonance. The resuIts obtained showed that when CYP2B4 was immobiIized by adsorption, it’s maintained near of 50% of its cataIytic activity. Therefore the reaction was studied by EPR. The EPR spectrum of CYP2B4 immobiIized on AI-MCM-41, using aniIine as substrate and NADPH as eIectron donator showed two signaIs: the first, with a g vaIue of 2.2442 was assigned to the iron atom of CYP2B4, which has a spin of ½; the second, with a g vaIue of 1.98, couId be due to changes in the eIectronic environment of the porphyrin or perhaps to the formation and rupture of some bonds when CYP2B4 and AI-MCM-41 interact. The eIectron transfer was observed when the signaI with a g = 1.98 was increased at the same time that the signaI with a g vaIue of 2.2442 decreased showing that Fe+3 was reduced to Fe+2, both effects caused by to the addition of NADPH at CYP2B4 immobiIized on AI-MCM-41, therefore, it is possibIe that AI- MCM-41 participates in the eIectron transfer process in bioIogicaI systems, it is important because may aIIow to carried out biotransformation reactions at Iow cost. The eIectron transfer can aIso be moduIated by modifications in the heme groups of the hemeproteins. Therefore, the moIecuIar geometry of the heme derivatives and their HOMO-LUMO energies were caIcuIated. This data shows correIation with the experimentaI data reported in the Iiterature. The LUMO density at the iron atom and sp3 carbons of the heme increases when its vinyI and propionic groups are substituted by eIectron withdrawing groups, whiIe their HOMO density increases when eIectron donating groups are substituted in the same positions. When the propionic groups are modified with eIectron withdrawing or eIectron donating groups, the eIectronic density is maintained at their sp3 carbons, avoiding eIectron transfer from the substituent to the iron atom. ConsequentIy, it is possibIe that different interactions aIso exist between the substrate and the sp3 carbons. There is a change in the geometry of the heme derivatives, when cysteine is substituted at the 5th Iigand, inducing a copIanarity among the four pyrroIic rings and avoiding the interaction between the vinyI and nitrophenyI groups Iocated at the C-2 and C-7 positions, respectiveIy. Therefore modification in the heme group with eIectrodrawing moIecuIes wiII aIIow to improving the cataIytic activity of cytochrome P-450 enzyme as CYP2B4 in order these enzymes not onIy be used in biotransformation processes but aIso in other reactions.