Modificación genética del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii con genes involucrados en la síntesis de polihidroxialcanoatos

Abstract

El polihidroxibutirato (PHB) es el miembro más sencillo y estudiado de los polihiroxialcanoatos, polímeros biodegradables con propiedades termoplásticas, producidos por una gran cantidad de especies bacterianas. Tres enzimas se encuentran involucradas en la producción de PHB a partir De acetilCCoA, una βCcetotiolasa, Una acetoacetilCCoA reductasa y una PHB sintasa. La producción actual de PHB está siendo llevada a cabo en fermentadores a gran escala. Sin embargo, los altos costos de producción limitan la utilización del PHB. Una alternativa a su produción podría ser en microalgas, las cuales pueden crecer de manera fotosintética y donde subproductos de alto valor asociado pueden ser producidos para aminorar los costos de producción del PHB.

EnestetrabajoreportamoslamodificacióndelcloroplastodeChlamydomonas+reinhardtiicon uno, dos y tres de los genes codificantes para las enzimas involucradas en la producción PHB.La transformación de cloroplasto se logró utilizando el plásmido p228, el cual confiere resistencia a espectinomicina, y plásmidos p320 que contenían casetes de expresión con versiones de phaA, phaB y phaC con uso de codones optimizado,dirigidos por los promotores endógenos PpsbA, PpsbD y PatpA. Las líneas transformadas contienen las combinaciones phaA o phaC, phaA+phaC y phaB+phaA+phaC.+ Después de tres rondas de selección sobre espectinomicina, se extrajo ADN de las transformantes y fue examinado por PCR para determinarlapresenciadelosgenesinsertadosutilizandodistintosprimersespecíficos.

Las líneas transformadas identificadas por PCR fueron cultivadas en medio TAP e incubadas con Rojo de Nilo, colorante lipofílico utilizado para la tinción in+ vivo de PHB, para ser analizadas por microscopía confocal de barrido laser (MCBL) mediante la cual se observó un cambio en el perfil de fluorescencia al comparar la línea control con las líneas transformadas p320ACyp320BAC.+

Además del análisis por MCBL, las líneas transformadas fueron analizadas por microscopía electrónica de transmisión (MET) para analizar los cloroplastos de las distintas líneas obtenidas. Mediante la MET se observó en las líneas p320AC y p320BAC la presencia de granulos característicos de la acumulación de PHB en cloroplastos de plantas.

Las líneas obtenidas serán caracterizadas más fondo por espectrometría de masas para determinar la naturaleza química de los gránulos observados en la MET.

Abstract Polyhydroxybutyrate (PHB) is the simplest and most studied member of the polyhydroxyalkanoates, biodegradable polymers with thermoplastic properties, produced by severalbacterialspecies.ThreeenzymesareinvolvedinPHBproductionfromacetylCCoA,aβC ketothiolase, an acetoacetylCCoA reductase and a PHB synthase. Current commercial production of PHB is being carried out in largeCscale fermentors. However, high production costs limit its use. An alternative to its production could be in microalgae, which can grow photosyntheticallyandwherehighCvaluebyproductscouldbeproducedtoreduceproduction costs.

Here we report Chlamydomonas+reinhardtii+chloroplast modification with one, two and three of the genes coding for the enzymes involved in PHB production. Chloroplast transformation was achieved using plasmid p228, which confers resistance to spectinomycin, and p320 containing expression cassettes with codon optimized versions of phaA, phaB and phaC, driven by the endogenous promotersPpsbA, PpsbD and PatpA. Transformed lines harb orphaA orphaC,phaA+phaCandphaB+phaA+phaC+genecombinations.Afterthreeselectionroundson spectinomycin, DNA was extracted and the transformants were screened by PCR for the presence of the inserted gene(s) using specific primers.

TransgeniclinesidentifiedbyPCRwerethengrownonTAPmedium,incubated with NileRed, a lipophilic dye used for in vivo PHB staining, and analyzed by confocal laser scanning microscopy(CLSM)whereachangeonthefluorescenceprofilewasobservedwhenwildtype werecomparedtop320ACandp320BAClines.

InaditiontoCLSM analysis, transplastomic lines chloroplasts were examined by transmission electronicmicroscopy(TEM).Granules often observed in PHB accumulating plant chloroplastswereobservedbyTEManalysisonp320ACandp320BAClines.

These lines will be further analysed by GCCMS to assess the chemical nature of the granules observed on the TEM analysis.