Separación de proteínas con actividad proteolítica de Bromelia karatas L chom por extracción líquido-líquido

Abstract

Bromelia karatas es una planta silvestre nativa de México que se encuentra principalmente en el sureste de México, donde se le conoce con el nombre maya de “chom”. Se estudió la separación por extracción bifásica acuosa (EBA) de las proteínas con actividad proteolítica de B. karatas analizando comparativamente el efecto de dos pesos moleculares de polietilénglicol (PEG), 1450 y 6000, en la partición. Se obtuvieron los diagramas de fases del sistema polietilénglicol (PEG)-fosfato de potasio (F-P) y las ecuaciones fueron ajustadas al modelo de Merchuck con un coeficiente de correlación de 0.99. Con base en la información obtenida de los diagramas de fase se ensayó la EBA del extracto de B.karatas (134.55 UT/mL de actividad caseinolítica) utilizando un diseño experimental de superficie de respuesta con un modelo central compuesto. Con el fin de conocer las mejores condiciones de extracción enzimática se analizaron cinco respuestas: el factor de purificación (en cada fase), el rendimiento, la constante de partición con respecto a la actividad enzimática (KE), la constante de partición con respecto a la concentración de proteína (KP) y la actividad proteolítica recuperada en cada fase. En la fase superior, el valor máximo del factor de purificación fue de 2.0 y se obtuvo con un sistema compuesto por 22 % (p/p) de PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P; mientras que el valor mínimo, 0.97, se presentó con la composición de 18 % (p/p) PEG-1450 y 25 % (p/p) F-P. En la fase inferior, el factor de purificación máximo, 4.2, se obtuvo con 22 % (p/p) PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P; en tanto que el mínimo, 1.6, se observó con 18 % PEG-1450 y 25 % (p/p) F-P. El rendimiento de recuperación enzimática global más alto fue 84.9 % y se obtuvo con la composición 22 % (p/p) PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P, y el mínimo, de 52.5 %, con 18 % (p/p) PEG-1450 y 25 % (p/p) F-P. La constante de partición KE tuvo un valor máximo de 1.3 con 22 % (p/p) PEG-1450 y 15 % (p/p) F-P, mientras que el valor mínimo, 0.66, se determinó con 18 % (p/p) PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P. La constante de partición KP de 2.81 se obtuvo como máximo utilizando 22 % (p/p) PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P, mientras que el valor mínimo fue de 1.54 con 18 % (p/p) PEG-1450 y 15 % (p/p) F-P. En la fase superior la actividad proteolítica recuperada fue de 80.3 % utilizando 22 % PEG-6000 y 25 % F-P, el valor mínimo de 36.6 %, fue con 18 % PEG-1450 y 25 % F-P, En tanto que en la fase inferior, la máxima recuperación fue de 33.4 % utilizando 18 % (p/p) PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P y la mínima, de 20 %, se presentó con 22 % (p/p) PEG-6000 y 25 % (p/p) F-P. Finalmente, la optimización indicó que las condiciones con las que se obtiene la mejor recuperación enzimática son PEG-6000 al 22 % (p/p) y 25 % (p/p) de fosfato de potasio, resultando en un rendimiento de recuperación enzimática del 85 %, constante de partición KE y KP de 1.22 y 2.8, respectivamente, y la actividad proteolítica recuperada del 80.3 % en la fase superior y 20 % en la fase inferior.

Abstract. Bromelia karatas is a wild plant native to Mexico that is found primarily in southeastern Mexico, where he was known Mayan "chom". Separation was studied by aqueous two-phase extraction (EBA) of proteins with proteolytic activity of B. karatas comparatively analyzing the effect of two molecular weight polyethylene glycol (PEG), 1450 and 6000, in the partition. We obtained the phase diagrams of the system polyethylene glycol (PEG)-potassium phosphate (P-P) and the equations were adjusted Merchuck model with a correlation coefficient of 0.99. Based on the information obtained from the phase diagrams EBA assayed B. karatas extract (134.55 UT / mL of caseinolytic activity) using an experimental design response surface model with a central composite. In order to meet the best conditions for enzymatic extraction five responses analyzed: the purification factor (each phase), the yield, the partition constant with respect to enzyme activity (KE), the partition constant with respect to protein concentration (KP) and the proteolytic activity in each phase recovered. In the top phase, the maximum value of purification factor was 2.0 was obtained with a system consisting of 22 % (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P, while the minimum value, 0.97, was presented with the composition of 18% (w / w) PEG-1450 and 25% (w / w) P-P. In the bottom phase, the maximum purification factor, 4.2, was obtained with 22% (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P, while the minimum, 1.6, was observed with 18% PEG -1450 and 25% (w / w) P-P. The highest enzymatic recovery global yield was 84.9% and was obtained with the composition 22% (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P, and the minimum of 52.5%, with 18% (w / w) PEG -1450 and 25% (w / w) P-P. The partition constant KE had a maximum value of 1.3 with 22% (w / w) PEG-1450 and 15% (w / w) P-P, while the minimum value, 0.66, was determined with 18% (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P. The partition constant KP of 2.81 was obtained using maximum 22% (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P, while the minimum value was 1.54 with 18% (w / w) PEG-1450 and 15% (w / w) PP. In the top phase recovered activity was 80.3% using 22% PEG-6000 and 25% P-P, the minimum value of 36.6 %, was 18 % PEG-1450 and 25% P-P While in the bottom phase, the maximum recovery was 33.4 % using 18 % (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P and the minimum of 20%, was 22% (w / w) PEG-6000 and 25% (w / w) P-P. Finally, said optimizing the conditions that yields the best enzymatic recovery are PEG-6000 to 22% (w / w) and 25% (w / w) potassium phosphate, resulting in a enzymatic recovery yield of 85%, and KE partition constant KP of 1.22 and 2.8, respectively, and 80.3% of the recovered activity in the top phase and 20% in the bottom phase.