Sobreexpresión de una enzima proteolítica de Jacaratia mexicana en Escherichia coli

Abstract

Las proteasas cisteínicas son importantes debido a que participan en procesos fisiológicos celulares fundamentales así como en procesos patológicos de mamíferos. Además, las proteasas cisteínicas de origen vegetal son utilizadas en la industriacervecera, alimentaria y farmacéutica. Jacaratia mexicana, planta silvestre, contiene proteasas miembros de la familia de la papaína CI como la mexicaína y quimomexicaína que tienen mayor actividad enzimáticaque la papaína. Dada la importanciacientífica y de aplicaciones industriales de esta enzimas,en esta tesis se propone una alternativa de producción de dichas enzimas de J. mexicana mediante la sobreexpresión de estas en Escherichia coli y en Pichia pastoris.

Para lograr los objetivos, se diseño y construyó un sistema de expresión: I) con el vector pET28b que contiene el promotor T7. La construcción permitió la expresión de las proteasas recombinantes JmCP4 (péptido señal, pro-péptido y proteína madura) y JmCP5 (pro-péptido y proteína madura) en E. coli BL21star (DE3). La expresión de las proteasas recombinantes se confirmaron con western blot con anticuerpos anti-mexicaína y zimografía. Con las cepas trasformadas de E. coli BL21star (DE3) se lograronrendimientos de proteína pura JmCP4 (10 mg/L) con actividad específica de 29.8 U/mg para JmCP4 y de 21.7 U/mg para JmCP5; y II) el gen JmCP4 de J. mexicana fue clonado en el vector comercial pPIC9 y expresado en P. pastorisGS115 con el promotor AOX1. La proteasa JmCP4 fue expresada como zimógeno (pro-péptido y proteína madura) 2 días después de la inducción con metanol. La cepa obtenida, P. pastoris GS115-JmCP produce y secreta una proteasa cisteínica al medio de cultivo con un rendimiento estimado de 23 mg/L. Se determinó que la proteína de interés corresponde a una proteína de 36 kDa por SDS- PAGE, con western blot y por zimograma. La proteína presentó actividad específica de 91.9 U/mg aprox. 3 veces mayor a la de papaína purificada y cristalizada 2X de una preparación comercial.

Por primera vez, se cuenta con dos sistemas de producción de estas proteasas de J. mexicana en E. coli BL21 y P. pastoris GS115-JmCP4, cepas obtenidas en este trabajo.

Papain-like cysteine proteases are important and the most numerous family of the cysteine protease class. They are involved in a fundamental physiological process of plant cells. And papain-like cysteine proteases have been identified as critical components of the pathological process of mammalians. Moreover, plant cysteine proteases are used in brewery, food and pharmaceutical industry. Jacaratia mexicana wild plant contains papain- like cysteine proteases family (C1) like mexicain and chymomexicain. The goal of this work was to obtain two alternative systems to produce active cysteine proteases from J. mexicana by heterologous expression systems, Escherichia coli and Pichia pastoris.

To reach these objectives expression systems were designed and constructed: I) with pET28b vector with T7 promoter. This system over-expressed recombinant JmCP4 (signal peptide, pro-peptide and mature protein) JmCP5 (pro-peptide and mature protein) in E. coli BL21star (DE3). The recombinant proteases were identified by western blot and zimography. The procedure yielded purified mature enzyme JmCP4 (10 mg/L) of active enzyme of E. coli culture. Specific activity was 29.8 U/mg of JmCP4 and 21.7 U/mg of mCP5; and II) cysteine protease gene of J. mexicana was cloned in pPIC9, and expressed in the heterologous Pichia pastoris GS115 with the AOX1 promoter. Protease JmCP4 was expressed as zymogene (pro-peptide y mature protein) two day of growth after induction with methanol. P. pastoris GS115-JmCP produced and secreted a recombinant cysteine protease with an estimated yield of 23 mg/L. The recombinant protease showed a 36-kDa band in SDS-PAGE and was positive by western blot and zymogram. The recombinant protease JmCP4 had a specific activity of 91.9 U/mg; this value is 3 times higher than a purified papain commercial preparation.

Two systems of cloning and expression of CPs from J. mexicana (E. coli BL21 y P. pastoris

GS115-JmCP4) are reported here for the first time. These systems were obtained in this thesis.