Caracterización estructural del promotor del gen Ehrad54 y análisis de la expresión y localización celular de la proteína Ehrad54 de entamoeba histolytica en respuesta al daño al DNA

Abstract

RESUMEN: La Recombinación Homóloga (RH) además de ser el mecanismo mediante el cual se logra la variabilidad genética durante la replicación del DNA, también es un mecanismo altamente eficiente para la reparación del mismo, sobre todo cuando se trata de daños tan severos como la Ruptura de Doble Cadena (DSB). En parásitos protozoarios, la RH puede inducir rearreglos en el genoma que modifican la expresión de genes para regular la variación antigénica, multirresistencia a drogas y virulencia. Recientemente, nuestro grupo de trabajo detectó la posible maquinaria de RH en Entamoeba histolytica, el protozoario causante de la amibiasis humana. En particular se identificó una posible EhRAD54 que es indispensable para la formación y estabilización del núcleofilamento así como para el intercambio de cadenas homólogas en otros organismos. Mediante ensayo de microarreglo, se demostró que el gen Ehrad54 se sobreexpresa en respuesta al daño genotóxico, no asi el gen parálogo Ehrad54b. El análisis in silico de los promotores de los genes sobreexpresados en respuesta al daño al DNA, incluyendo al gen Ehrad54, permitió la identificación de secuencias que pudieran controlar su transcripción, y que están ausentes en el promotor del gen parálogo Ehrad54b. El gen Ehrad54 codifica para una posible proteína EhRAD54 de 100 kDa (884 aminoácidos), la cual presenta una homología del 58 al 61% con las proteínas homologas de otros organismos y esta filogenéticamente relacionado con las mismas. Estructuralmente, tiene la característica forma bilobulada de esta familia de proteínas y cuenta con el dominio de helicasa y los siete típicos motivos de la superfamilia SWI2/SNF2. El extremo 5´ (581 pb) del gen Ehrad54 (2655 pb) se clonó en el vector pGEX6p1 para inducir la expresión del péptido recombinante EhRAD54-GST (47.5 kDa) en bacterias Escherichia coli. Mediante la inoculación en ratones de un péptido antigénico sintético (PAS) correspondiente al extremo amino de EhRAD54 (15 aminoácido), obtuvimos anticuerpos que reconocieron específicamente a EhRAD54-GST. Estos anticuerpos se utilizaron para evaluar la expresión de la proteína EhRAD54 nativa en trofozoítos sometidos al modelo de daño al DNA inducido con luz UV-C (150 J/m2). EhRAD54 se expresa de manera constitutiva en extractos nucleares y su expresión aumenta a los 5 minutos después del daño al DNA, lo que sugiere que pudiera participar en reparación del DNA mediante el proceso de RH en este parásito.

ABSTRACT: DNA double strand breaks (DSB), the most lethal DNA damage, is caused by UV rays, ionizing radiations or genotoxic agents. It also occurs in collapsed forks restoration during replication, mitosis and meiosis. DSB affects genome integrity and survival. Homologous recombination (HR) is an accurate mechanism to repair DSB in both prokaryotic and eukaryotic cells. It is also used to generate genetic diversity. In protozoan parasites, HR generating antigenic variation and genomic rearrangements, is responsible for virulence variation and drug resistance. We have recently reported the identification of the HR machinery in Entamoeba histolytica, the protozoan parasite responsible for human amoebiasis. Particularly, we identified a gene that codify for a putative EhRAD54 protein that is involved in nucleofilament stabilization and DNA exchange in other organisms. Moreover, microarrays assays showed that Ehrad54 is overexpressed in response to genotoxic damage, but no the paralogous Ehrad54b gene. In silico analysis of promoters corresponding to genes overexpressed after DNA damage, including the Ehrad54 gene, allowed the identificaction of sequences that could control their transctiption, and that are not present in the promoter of the paralogous Ehrad54b gene. The Ehrad54 gene codify for a putative 100 kDa EhRAD54 protein (884 aminoacids) which presents 58-61% homology with homologous proteins from other organisms and is phylogenetically related to them. EhRAD54 has the typical bilobulated structure of this RAD54 family and presents the helicase domain with the seven characteristic motifs of the SWI2/SNF2 superfamily. The 5´ end (581 bp) of Ehrad54 gene (2655 bp) was cloned into the pGEX6p1 vector to induce the expression of the recombinant peptide EhRAD54-GST (47.5 kDa) in Escherichia coli. Through the inoculation of mice with a synthetic peptide (PAS) corresponding to the amino end of EhRAD54 (15 aminoacids), we obtained antibodies that specifically recognized EhRAD54- GST. These antibodies were used to evaluate native EhRAD54 expression in trophozoites irradiated with 254 nm UV-C (150 J/m2). EhRAD54 is constitutively expressed in nuclear extracts and its expression is increased at 5 minutes after DNA damage, suggesting that EhRAD54 could be participating in DNA repair by HR in this parasite.