Estudio clínico, inmunológico y genético de pacientes con defecto en el estallido respiratorio: función de NCF4 y NRAMP1

Abstract

RESUMEN: Las inmuhodeficiencias primarias (PID) son un grupo heterogéneo de enfermedades genética que afectan el desarrollo o fución del sistema inmunológico. El diagnóstico de PID puede realizarse evaluando de manera como la secuenciación de nueva generación (NGS). La NGS consiste en la secuenciación masiva del exoma, genoma o transcriptoma de pacientes. A partir de la utilización de NGS en el 2010, se han descrito más de 100 nuevos genes asociados a un defecto inmunológico. La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es una inmunodeficiencia primaria que afecta el complejo NADPH oxidasa, causando defectos en el estallido respiratorio. Los pacientes con EGC sufren de infecciones invasivas y severas, por lo general son diagnosticados a edades tempranas y a la fecha los tratamientos consisten en profilaxis con antibióticos y antifúngicos, las curas para esta enfermedad son el trasplante de médula ósea y en algunos casos la terapia génica. Se analizó por NGS el exoma completo depacientes con infecciones recurrentes y que no habían sido diagnosticados previamente con alguna inmunodeficiencia primaria, del análisis realizado se encontraron mutaciones en los genes NCF4 y SLC11A1 las cuales fueron caracterizadas en modelos de sobreexpresión utilizando células HEK-293T y células EBV-B. Asimismo, se evaluó la actividad del complejo NADPH oxidasa en neutrófilos de los pacientes utilizando un modelo de retro-transducción viral en células EBV-B de pacientes con deficiencia en p40phox. Se encontraron 24 pacientes con deficiencia en p40phox, los pacientes presentaron siete mutaciones no descritas. Se caracterizaron funcionalmente los alelos demostrando que todos son perdida de función a excepción de los alelos c. 120_134del y p. R58C que son hipomórficos. Al evaluar las células de pacientes se encontró que todas las células evaluadas presentan defecto en la expresión de p40phox a excepción de los pacientes con mutaciones en p. R58C y p. R105Q. Se encontró que el estallido respiratorio inducido por PMA es residual en polimorfonucleares de lospacientes, en donde el efecto era siempre más elevado comparada a las células de pacientes con EGC crlásica. Sin embargo, al utilizar líneas celulares EBV-B de los pacientes, todos mostraron defectos en el estallido respiratorio con PMA. Posteriormente, se realizó el rescate genético de EBV-B de pacientes con deficiencia en p40phox insertando el gen silvestre de p40phox mediante retro-transducción viral. Se encontró que sólo las células rescatadas con p40phox silvestre recuperan la actividad del complejo NADPH oxidasa en este sistema, comprobando así que la ausencia de p40phox es la responsable del defecto el estallido respiratorio. Adicionalmente, utilizando la NGC se encontró el primer paciente con deficiencia en SLC11A1, gen que codifica para la proteína NRAMP1. Se evaluó la actividad de la NADPH oxidasa en polimorfonucleares y monocitos del paciente, se encontró defecto exclusivamente en los polimorfonucleares. Se evaluó la cantidad de RNA mensajero en polimorfonucleares y se observó que no hay diferencia en el nivel de transcritos comparado a controles sanos. Finalmente, se evaluó el alelo mutado p V484M en un modelo de sobreexpresión en células HEK-293T y se encontró que la expresión de NRAMP1 a nivel de proteína se ve disminuida. El uso de la NGS es útil para el diagnóstico genético de pacientes con inmunodeficiencias y permite la descripción de nuevas etiologías genéticas. Con respecto al gen NCF4-p40phox. Se describieron 24 nuevos casos con deficiencia de p40phox y se caracterizaron 7 nuevas mutaciones de p40phox. La deficiencia de p40phox difiere de la EGC al presentar mayor número de infecciones superficiales y mayor desregulación de la respuesta inmune en contraste a las recurrentes infecciones severas e invasivas observadas en EGC. Finalmente, respecto al gen SLC11A1 - NRAMP1 se describió al primer paciente con deficiencia en RAMP1 la cual es célula-específica afectando exclusivamente a los neutrófilos.