Identificación molecular de las especies más frecuentes causantes de candidosis sistémica

Abstract

ABSTRACT: Systemic candidiasis is one of the most frequent causes of morbility and mortality in immunosuppressed patients. Therefore, the rapid and accurate detection and identification of involved Candida species is essential for patient antifungal treatment. The traditional diagnosis procedures as the culture and physiological tests are time-consuming and their sensitivity and specificity are limited. In the present work the PCR conditions were established using species-specific primers which amplify a region of ITS1 and ITS2 producing different size fragments for C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata and C. parapsilosis, species observed with highest frequency in patients candidosis. Universal primers which amplify a 5.8S rDNA were also used. The four primers’s sensitivity range was between 1 and 10 pg of genomic DNA (equivalent to 27 and 270 yeasts respectively) obtained from type strains and clinical isolates. The technique specificity for Candida species identification compared with other genus yeasts was 100%. The PCR sensitivity with blood specimens inoculated with four Candida species was 100 yeasts. In order to know the PCR technique efficiency in clinical specimens, a total of 81 biological samples from immunosuppressed patients were included: bronchial liquid (n=25), sputum (n=17), peritoneal liquid (n=5), gall bladder liquid (n=1), secretion (n=1), bone marrow (n=1), tracheal cannula (n=1), lymph node (n=1), non specific liquid (n=1). Molecular identification was correlated with culture on Sabouraud dextrose agar and CHROMagar Candida. Candida species were detected by PCR in 52% of total specimens and by culture in 37%. Out of PCR-positive specimens, only 69% were positive by culture. From PCR-positive bronchial liquids, 65% was positive by culture, whereas the 3 blood specimens, each of pleural liquid and lymph node which were PCR-positive, all five were culture-negatives. Out of PCR-negatives specimens, only one was culture-positive. C. albicans was identified in 81% of clinical specimens followed by C. tropicalis (33%), C. glabrata (26%) and C. parapsilosis (5%). From all PCR-positive clinical specimens, in 64% one species and in 36% two or three species were detected. From specimens where two species were detected (73%), the most (82%) was culture-positive but only for one species. From specimens where three species were detected, the most (75%) were culture-positive, but only for two species. Of all PCR-positive specimens (using species-specific primers), 83% was positive with the universal fungal primers; however. Results obtained in this work demonstrate that PCR is a rapid, reliable, specific and sensitive alternative to detect and identify the Candida species in clinical specimens in high risk suspected of having a systemic candidosis.

RESUMEN: La candidosis sistémica es una las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes inmunocomprometidos. Por lo tanto la detección e identificación rápida y certera de especies de Candida es esencial para el tratamiento de los pacientes afectados. Los procedimientos tradicionales de diagnóstico como el cultivo y las pruebas bioquímicas consumen tiempo y son muy limitadas en su sensibilidad y especificidad. En este trabajo se establecieron las condiciones de PCR utilizando iniciadores especie-específicos que amplifican una parte de ITS1 e ITS2 generando fragmentos de tamaño diferente para C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata y C. parapsilosis, especies que se observan con mayor frecuencia en pacientes con candidosis. Se utilizaron también iniciadores universales que amplifican parte del DNA ribosomal 5.8S. El rango de sensibilidad de la PCR para los cuatro iniciadores fue de 1 a 10 pg de DNA (equivalente a 27 y 270 levaduras respectivamente) total obtenido de cepas tipo y aislados clínicos. La especificidad de la técnica para la identificación de especies de Candida comparada con levaduras de diferentes géneros fue de 100%. La sensibilidad de la PCR con muestras de sangre inoculadas con levaduras de las cuatro especies de Candida fue de 100 levaduras. Para conocer la aplicabilidad de la técnica de PCR en muestras clínicas, se utilizó un total de 81 productos biológicos de pacientes inmunocomprometidos: lavados bronquiales (n=25), esputo (n=15), sangre (n=19), líquido pleural (n=7), orina (n=2), LCR (n= 2), líquido peritoneal (n=5), líquidos de vesícula (n=1), secreción (n=1), médula ósea (n=1), cánula traqueal (n=1), ganglio (n=1) y líquido (n=1). La identificación molecular se correlacionó con el cultivo en agar dextrosa Sabouraud y en CHROMagar Candida. Las especies de Candida presentes en las muestras clínicas fueron detectadas por PCR en el 52% y por cultivo en el 37%. De las muestras positivas por PCR, sólo el 69% fueron positivas por cultivo. De las muestras de lavado bronquial positivas por PCR, el 65% fue positivo por cultivo; mientras que las 3 muestras de sangre, una de líquido pleural y una de ganglio que fueron positivas por PCR, las cinco fueron negativas por cultivo. De todas las muestras negativas por PCR, sólo una fue positiva por cultivo. C. albicans fue detectada en el 81% las muestras clínicas, seguida de C. tropicalis (33%), C. glabrata (26%) y C. parapsilosis (5%). Del total de muestras clínicas positivas por PCR, en el 64% se detectó una sola especie y en el 36% se detectaron 2 ó 3 especies. De las muestras en que se detectaron dos especies (73%), en la mayoría (82%) el cultivo fue positivo, pero solo para una especie. De las muestras en que se detectaron 3 especies por PCR (27%), la mayoría (75%) fueron positivas por cultivo, pero solo se detectaron 2 especies.De las muestras positivas por PCR con iniciadores especie-específicos, el 83% fueron positivas con los iniciadores universales. Los datos obtenidos en este trabajo demuestran que la PCR es una alternativa rápida, confiable, específica y sensible para detectar e identificar las especies de Candida en las muestras clínicas de los pacientes de alto riesgo con sospecha de portar una candidosis sistémica