Caracterización molecular y funcional de la proteína EHBLM de entamoeba histolytica

Abstract

RESUMEN: La recombinación homóloga (HR) es uno de los principales mecanismos involucrados en la reparación de la ruptura de la doble cadena de DNA (DSB, por sus siglas en inglés), un evento molecular que puede afectar gravemente las funciones y la supervivencia de la célula. La HR también permite la diversidad genética. La HR involucra a más de 11 proteínas incluyendo la DNA helicasa de Bloom (BLM), la cual pertenece a la familia de proteínas RecQ que catalizan el desenrrollamiento del DNA asociado a la hidrólisis de ATP-dependiente de DNA. Cinco proteínas RecQ han sido descritas en humano y mutaciones en tres de ellas se han asociado con cáncer y muerte prematura, indicando su relevancia para la integridad genómica y el mantenimiento de la viabilidad celular. Entamoeba histolytica, el parásito protozoario responsable de la amibiasis humana, presenta diferentes grados de virulencia que se han relacionado con una gran variabilidad genética probablemente debida a eventos de recombinación. Por análisis in silico del genoma de E. histolytica, se identificó la posible maquinaria involucrada en la HR en este parásito. Particularmente, se detectó un gen (3548 nucleótidos) que codifica para una posible DNA helicasa de la familia RecQ (EhBLM) así como otros dos genes EhRecQ. En particular, EhBLM posee el dominio de helicasa con los ocho motivos conservados en la familia RecQ involucrados en el desenrrollamiento del DNA en proteínas homólogas. También presenta los dominios RecQ-CT y HRDC que participan en la unión al DNA y en la interacción con proteínas. El dominio de helicasa de EhBLM amplificado por PCR fue clonado en el vector de expresión pGEX-6P1 para expresar en bacterias a la proteína recombinante EhBLM-GST, la cual fue purificada por cromatografía de afinidad usando columnas de sefarosa acoplada a glutatión. Los resultados de los ensayos de retardamiento de la movilidad electroforética, sugieren que la proteína rEhBLM-GST es capaz de unirse a las estructuras de DNA en forma de “X” e “Y”, lo que indica que la proteína EhBLM podría participar en eventos relacionados con la replicación del DNA y la recombinación homóloga en E. histolytica.

ABSTRACT: Homologous recombination (HR) is one of the mechanisms involved in double strand DNA break (DSB) repair, a molecular event that can strongly affect cell functions and survival. Moreover, HR allows genetic diversity. HR process involves 11 proteins including the Bloom DNA helicase (BLM), which belongs to the RecQ family proteins that catalyze DNA unwinding through DNA dependent hydrolysis of ATP. Five RecQ proteins homologues have been described in human and mutations in three of them have been associated with cancer and premature death, indicating their relevance for genomic integrity and cellular viability maintenance. Entamoeba histolytica, the protozoan parasite responsible for human amoebiasis, presents different virulence grades that have been related with genetic variability, probably due to recombination events. By computational screening of E. histolytica genome, we identified the possible machinery for HR in this parasite. Particularly, we detected a gene (3548 nt) that codes for a possible DNA helicase of the RecQ family (EhBLM) and two additional RecQ genes. Notably, EhBLM has the helicase domain with the seven conserved motifs of the RecQ family that have been involved in DNA unwinding in homologous proteins. EhBLM also presents the RecQ-CT and HRDC domains that participate in DNA binding and protein interaction. The PCR-amplified EhBLM helicase domain was cloned into the pGEX-6P1 vector to express the rEhBLM-GST protein in bacteria, which was purified by affinity chromatography using glutathion-sepharose columns. Electrophoretic mobility shift assays suggested that the rEhBLM protein was able to bind DNA structure “X“ and “Y“ which indicates that EhBLM could act in replication and homologous recombination in E. histolytica.