Purificación y modelado molecular de la proteína pro-apoptotica bax

Abstract

RESUMEN: Bax es un miembro de la familla Bcl-2 que tiene un papel importante en la inducción de la apoptosis. Esta proteína se ha detectado en la membrana mitocondrial externa (MEM) como consecuencia de un estrés celular, involucrando una homo- o hetero-dimerización. En esta tesis reportamos la clonación del vector pET28a-Bax que permitió la expresión y purificación de la proteína Bax humana recombinante (23 kDa). Además, la fluorescencia intrínseca del triptófano (FT) y la espectroscopia de dicroísmo circular (DC) evidencian que la proteína se obtuvo en forma de monómero, y que su estructura secundaria coincide con la reportada previamente. Por otro lado, debido a que el mecanismo molecular de la interacción de Bax con la MEM no se ha aclarado por completo, construimos un sistema DPPC-H2O-Bax para simular el comportamiento global de los componentes estructurales de Bax dentro de una bicapa lipídica mediante dinámica molecular. Interesantemente, las hélices alfa que se han reportado como hidrofóbicas o hidrofílicas corresponden a una localización respectiva en la membrana en la mayor parte de la simulación. Esta tesis propone un método alternativo para obtener a la proteína Bax humana y se hipoteiza acerca de sus dominios de interacción con la membrana.

ABSTRACT: Bax is a member of the Bcl-2 family that plays a key role in apoptosis induction. This protein has been detected in mitochondrial external membrane (MEM) as a result of a cellular stress, and it undergoes both homo- or hetero- dimerization. Herein we report the obtaining of pET28a-Bax vector that allowed the expression and purification of a human recombinant Bax protein (23 kDa). Additionally, Trytophan-fluorescence (TF) and circular dichroism spectroscopy (CD) evidenced that a monomeric form was obtained, and its secondary structure coincided with the previously reported. In turn, as molecular mechanism of the interaction of Bax with MEM has not fully clarified, we constructed a DPPC-H2O-Bax system to simulate the global behavior of Bax structural components within a lipid bilayer by molecular dynamics. Interestingly, alpha-helices that have been reported as hydrophobic or hydrophylic corresponded with a respective location on membrane for most simulation. This thesis proposes an alternative method to obtain human Bax protein and hypothesize about interaction of Bax with the membrane.