Producción de radicales libres del oxígeno y rearreglos del citoesqueleto en células enduteliales de cordón umblical humanas infectadas por microbacterias

Abstract

RESUMEN: Recientemente se ha empezado a reconocer la participación de las células de tipo no fagocítico en la tuberculosis. Previamente demostramos que las células endoteliales de cultivo primario de cordón umbilical de humano (HUVEC), son susceptibles de infectarse con micobacterias, y producir y modular la producción de óxido nítrico (NO), en respuesta a la infección. El objetivo de este trabajo fue analizar la participación de especies reactivas del oxígeno (ROS), así como determinar la vía endocítica que utilizan las micobacterias para interiorizarse en las HUVEC. Esto se llevó a cabo infectando a las HUVEC con: Mycobacterium smegmatis (MSM), Mycobacterium abscessus (MAB), y Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB). Se estimó la producción de ROS por microscopía óptica y cuantificando por espectrofotometría la capacidad de reducir el reactivo NBT (Nitroazul de tetrazolio); la vía de interiorización se estableció por microscopía confocal, microscopía electrónica de barrido y mediante el uso de inhibidores. Se observó que MSM indujo la mayor producción de ROS, seguida de MTB; la micobacteria que indujo menor producción fue MAB. Se observó por microscopía confocal que las tres micobacterias estimularon el rearreglo del citoesqueleto, también de manera diferencial, siendo MAB la que indujo una mayor distribución de los filamentos de actina, comprometiendo la morfología celular, con MTB se observó un efecto similar al de MAB, aunque en un menor grado. La cepa de MSM fue la que indujo de una manera discreta la distribución de los filamentos de actina, básicamente en la periferia sin comprometer la estructura celular. La microscopía de barrido demostró que en la infección con MAB se produjeron grandes y abundantes lamelipodios y ruffles, las imágenes con MTB fueron similares, en cambio la infección con MSM indujo pocos y discretos lamelipodios y muy poca alteración de la estructura celular con excepción de un hinchamiento de la zona perinuclear. Estas observaciones sugieren a la macropinocitosis como el mecanismo responsable de la interiorización, hecho que se confirmó por la utilización del amilorido, compuesto que redujo la interiorización de las tres micobacterias de manera significativa. Interesantemente la wortmanina, únicamente inhibió la interiorización de MTB y MSM, sugiriendo que MAB durante su infección no activa a la PI3-K. En las HUVEC las micobacterias utilizan la macropinocitosis para interiorizarse y su eliminación depende de la producción de ROS, y la activación de la PI3-K.