Estudio de metiltransferasas involucradas en la resistencia a antibióticos en cepas de bacilos Gram negativos no fermentadores de origen clínico

Abstract

ABSTRACT: Multidrug resistant nonfermenters Gram negative bacilli (NFGNB) are emerging pathogens and a worldwide threat mainly due to the widespread antibiotic resistance and the increasingly narrow therapeutic options. Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and Acinetobacter spp., are nosocomial pathogens associated with high mortality and treatment failure. Aminoglycosides are potent bactericidal antibiotics targeting the bacterial ribosome, where they bind to the A site and disrupt protein synthesis. Recently, an important antibiotic resistance mechanism mediated by 16S rRNA methyltransferases has been described in NFGNB that confer a high level of resistance to almost all clinically important aminoglycosides. These enzymes add a methyl group to specific ribonucleotides in antibiotic-binding sites of the ribosome, thereby disrupting the antibiotic binding without much interference with other functions of the ribosome. To date, six 16S rRNA methyltransferases have been describe from different countries: RmtA, RmtB, RmtC, RmD, NpmA and ArmA. Up to the present time, in Mexico there is no published research on this important mechanism of resistance in NFGNB. The aim of this study was to detect and identify 16S rRNA methyltransferases genes involved in aminoglycoside resistance in NFGNB of clinical origin. Eighty Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia or Acinetobacter spp. isolates from three different hospitals, were screened for the presence of 16S rRNA methyltransferases based on phenotypes that were resistant to at least one of four tested aminoglycosides, the methyltransferases genes were identified by PCR and DNA sequencing. In this study, we report the first finding of armA in a clinical isolate of Acinetobacter spp. (HI3) in Latin America, which showed resistance to amikacin, gentamicin, tobramycin and neomycin. The armA gene presence in this strain explains the resistance to aminoglycosides 4, 6-disubstituted 2-deoxystreptamines, but not to neomycin, which can be due to another resistance mechanism like efflux pumps or change of permeability of the membrane. Genetic and Southern hybridization analyses revealed that the armA gene of Acinetobacter spp. HI3 resides on a plasmid of approximately 11,500pb in ~5,000 bp EcoRV, ~5,000 bp PstI, ~4,500 bp BglII or ~900 bp NcoI fragments. In addition, a class 1 integron was detected in Acinetobacter spp. HI3 genome containing two genes, aadA1 and aacA4, that encode two aminoglycoside modified enzymes. Interestingly, a possible methyltransferase gene was identified in S. maltophilia INP1 clinical isolate obtained from a cystic fibrosis patient, this bacterial strain also presented resistance to amikacin, gentamicin, tobramycin and neomycin. The DNA sequencing showed a novel sequence no deposited in GenBank. The bioinformatics analysis suggested that the translated putative methyltransferase of S. maltophilia INP1 is related with RmtC, but is required to obtain the complete gene to associate its biological activity to antibiotic resistance due to ribosome targeting. This is the first report of ArmA 16S rRNA methyltransferase in Acinetobacter spp. in Latin America and also the first finding of a novel sequence in S. maltophilia encoding a hypothetical methyltransferase related to RmtC. Our results indicate that bacteria carrying methyltransferases related to antibiotic resistance are present in Mexico and their association with nosocomial infections makes it essential to control better the use of antibiotics. Active surveillance is necessary to prevent the spread of clones carrying methyltransferases resistance genes associated with plasmids.

RESUMEN: Los bacilos Gram negativos no fermentadores (BGNNF) multifármaco-resistentes son patógenos emergentes y una amenaza en todo el mundo debido principalmente a la amplia resistencia a los antibióticos y las opciones terapéuticas cada vez más reducidas. Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y Acinetobacter spp., son patógenos nosocomiales asociados con alta mortalidad y con falla terapéutica. Los aminoglucósidos son potentes antibióticos bactericidas cuyo sitio blanco es el ribosoma bacteriano, donde se unen al A sitio e inhiben la síntesis de proteínas. Recientemente, se ha descrito un importante mecanismo de resistencia a los antibióticos mediado por rRNA 16S metiltransferasas en BGNNF, que confiere un alto nivel de resistencia a casi todos los aminoglucósidos clínicamente importantes. Estas enzimas añaden un grupo metilo a ribonucleótidos específicos en los sitios de unión del antibiótico en el ribosoma, interrumpiendo la unión del antibiótico sin mucha interferencia con otras funciones del ribosoma. Hasta la fecha, se han descrito seis rRNA 16S metiltransferasas en diferentes países: RmtA, RmtB, RmtC, RmD, NpmA y ArmA. A la fecha, en México no hay ninguna investigación publicada sobre este importante mecanismo de resistencia en BGNNF. El objetivo de este estudio fue detectar e identificar genes de rRNA 16S metiltransferasas implicados con la resistencia a aminoglucósidos en BGNNF de origen clínico. Ochenta aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia o Acinetobacter spp. provenientes de tres diferentes hospitales, se examinaron en busca de rRNA 16S metiltransferasas con base en su fenotipo de resistencia al menos, a uno de los cuatro aminoglucósidos empleados, los genes de metiltransferasas se identificaron mediante PCR y secuenciación del DNA. En este estudio, reportamos el primer hallazgo de armA en un aislado clínico de Acinetobacter spp. (HI3) en América Latina, el cual mostró resistencia a amikacina, gentamicina, tobramicina y neomicina. La presencia del gen armA en esta cepa explica la resistencia a aminoglucósidos 4, 6-disustituida 2-desoxiestreptamina, pero no a la neomicina, la cual puede ser debida a otro mecanismo de resistencia como bombas de eflujo o cambio de la permeabilidad de la membrana. El análisis genético y la hibridación tipo Southern revelaron que el gen armA de Acinetobacter spp. HI3 reside en un plásmido de aproximadamente 11, 500pb, en fragmentos de EcoRV ~5.000 bp, PstI ~5.000 bp, BglII ~4.500 bp o de NcoI de ~900bp. Además, se detectó un integrón de clase 1 en el genoma de Acinetobacter spp. HI3, que contiene dos genes, aadA1 y aacA4, que codifican dos enzimas modificadoras de aminoglucósidos. De forma interesante, se identificó un posible gen de metiltransferasa en un aislado clínico de S. maltophilia INP1 obtenido de un paciente con fibrosis quística, esta cepa bacteriana también presentó resistencia a amikacina, gentamicina, tobramicina y neomicina. La secuenciación del DNA mostró una secuencia nueva que no se encuentra depositada en el GenBank. El análisis bioinformático sugirió que la metiltransferasa putativa traducida de S. maltophilia INP1 está relacionada con RmtC, pero es necesario obtener el gen completo para asociar su actividad biológica con la resistencia a los antibióticos cuyo sitio blanco es el ribosoma. Este es el primer informe de la 16S rRNA metiltransferasa ArmA en Acinetobacter spp. en América Latina y también el primer hallazgo de una secuencia nueva en S. maltophilia que codifica una metiltransferasa hipotética relacionada con RmtC. Nuestros resultados indican que las bacterias que contienen metiltransferasas relacionadas con resistencia a antibióticos están presentes en México, y su asociación con infecciones nosocomiales hace que sea esencial controlar mejor el uso de antibióticos. La vigilancia activa es necesaria para evitar la propagación de clonas que contengan genes de metiltransferasas que confieran resistencia y estén asociados con plásmidos.