Caracterización del desplegamiento químico por urea de la enolasa de Saccharomyces Cerevisiae

Abstract

RESUMEN: En la actualidad se sabe poco acerca del mecanismo de plegamiento que siguen las proteínas para adquirir su estructura funcional. La enolasa es un sistema interesante de estudio tanto por su estructura como por su actividad catalítica en la vía de la glucólisis. La enolasa es una enzima que cataliza la deshidratación reversible del 2-D-fosfoglicerato a fosfoenol piruvato. Se trata de una molécula homodimérica que requiere del ión Mg2+ para llevar a cabo su actividad catalítica. Cada monómero tiene un peso molecular de 46.7 kDa con un sitio activo completo y tres sitios de unión para cationes divalentes. En este trabajo se estudió la reacción de desplegamiento de la enolasa inducida por la urea. Los cambios conformacionales debidos al desplegamiento se registraron por espectroscopia de fluorescencia. Los espectros de emisión de fluorescencia fueron obtenidos de la enolasa después de incubarse con distintas concentraciones de desnaturalizante. A partir de cada uno de los espectros se calcularon los valores del Centro de Masas Espectral y con ellos se construyeron curvas de transición. Las curvas de transición se analizaron mediante el ajuste de los datos experimentales a las ecuaciones que describen un modelo de desplegamiento de dos estados, así como a ecuaciones que describen modelos de tres o mas estados con intermediarios monoméricos o diméricos. El modelo que describió mejor los datos experimentales fue el que considera un intermediario en la ruta de desplegamiento, pero que no involucra la disociación del dímero en ninguna de las etapas de desplegamiento. El ajuste de los datos experimentales a las ecuaciones que describen este modelo permitió el cálculo de parámetros termodinámicos que están asociados a la reacción de desplegamiento. Además, se analizó el efecto de la presencia del grupo fosfato en la reacción de desplegamiento inducida por urea. Los resultados de esta tesis indican que el grupo fosfato le confiere estabilidad a la enolasa de S. cerevisiae, tanto al estado nativo como al estado intermediario. Sin embargo, el mecanismo de desplegamiento es similar en ambas condiciones experimentales.

ABSTRACT: Protein folding raises some of biology's greatest theoretical challenges. Enolase is an interesting model for folding/unfolding studies, because of its structure and its involvement in the glycolytic pathway. Enolase is an enzyme that catalyzes the dehydration of 2-phospho-D-glycerate to phosphoenolpyruvate. This homodimeric protein requires Mg2+ for its catalytic reaction. Each monomer of enolase have a molecular mass of 46.7 kDa, with a full active site, and three divalent-metal binding sites. In this work, the urea-induced unfolding of enolase from S. cerevisiae was studied. The conformational changes derived from the unfolding reaction were monitored by fluorescence spectroscopy. Enolase was incubated at several urea concentrations and fluorescence-emission spectra were recorded. Values of the spectral centre of mass were calculated from each spectra. Spectral Center of Mass values were used to obtain transition curves. These curves were analysed by fitting the experimental data to equations that describe diverse mechanisms of folding/unfolding, such as two-state model, and three-state models with and without dissociation of the dimer. It was found that the best model that described the experimental data was a three-state mechanism that involves the presence of one intermediate, but does not engage dissociation of the dimer into monomers. Fitting of the experimental data to equations that describe this pathway, allowed us to calculate the thermodynamic parameters associated to the unfolding reaction. Furthermore, the effect of phosphate group in the unfolding reaction of enolase from S. cerevisiae was analysed. It was observed that the phosphate group stabilizes the native and intermediate forms of the enzyme without changing the unfolding mechanism.