Obtención de un anticuerpo monoclonal anti a-enolasa humana y caracterización de su interacción con el antígeno

Abstract

RESUMEN: La Enolasa es una enzima de la vía glucolítica que cataliza la reacción reversible de deshidratación del 2-D-fosfoglicerato a Fosfoenolpiruvato y además es una proteína que se encuentra altamente conservada. En el humano existen tres isoformas de esta enzima: α, β y γ. De estas tres isoformas la α-enolasa humana se ha identificado como una proteína multifuncional ya que se ha reportado en distintos compartimentos celulares desempeñando diferentes funciones en varios organismos. Diversos autores han reportado la generación de anticuerpos monoclonales en contra de otras proteínas altamente conservadas y han encontrado resultados relevantes al evaluar la interacción de estos anticuerpos con sus antígenos. En este trabajo se generó un Anticuerpo Monoclonal (AcM) utilizando como antígeno a la α-enolasa humana recombinante con la cual se inmunizaron a cinco ratones hembra de la cepa Balb/C durante siete semanas y se evaluó la respuesta inmunológica de cada ratón mediante ensayos de ELISA indirecto. Posteriormente se realizó una esplenectomía al ratón que presentó una mejor respuesta inmunológica hacia el antígeno α-enolasa humana recombinante y se obtuvo el hibridoma mediante la fusión de las células del bazo del ratón con células de mieloma X63Ag8.653. Este hibridoma fue clonado y subclonado y para seleccionar tanto el hibridoma como sus clonas más afines al antígeno, los sobrenadantes celulares fueron evaluados mediante ensayos de ELISA indirecto utilizando como antígenos a la α-enolasa humana y a un péptido que se diseñó y mandó sintetizar para la selección de clonas. Este péptido se diseñó realizando un análisis in sílico de la secuencia y estructura tridimensional de la

α-enolasa humana y corresponde a una región de la secuencia de la α-enolasa humana que es poco conservada con respecto a las otras isoformas de enolasa humana, es inmunogénica y está expuesta al solvente en la estructura tridimensional. Finalmente la especificidad del AcM fue evaluada mediante ensayos de ELISA indirecto utilizando también otras enolasas como la de Saccharomyces cerevisiae y Trichomona vaginalis.

ABSTRACT: Enolase is a glycolytic enzyme that catalyzes the dehydration of 2-phospho-D-glycerate to phosphoenolpyruvate. In humans there are three isoforms: α, β and γ. One of them, α-enolase has been found to play different roles in a variety of cellular compartments and tissues. Monoclonal Antibodies against several proteins have been generated showing interesting results about the interaction between antigen-antibody that might have important implications in biomedicine. In this work we produced a monoclonal antibody using recombinant human α- enolase as antigen. Five female Balb/C mice were immunized with this antigen for seven weeks and the immunologic response was evaluated by indirect ELISA assay. Subsequently, the mouse that showed a better immune response to antigen recombinant human α-enolase was summited to splenectomy. Hybridomas were obtained by fusing the mouse spleen cells with myeloma cells X63Ag8.653. In order to select either the hybridoma or its clones, cell supernatants were screened by indirect ELISA using as antigens human α-enolase and a peptide that was designed and synthesized to control the selection of clones. This peptide was designed by in silico analysis of the sequence and the three-dimensional structure of human α-enolase and corresponds to a region of the sequence of human α-enolase that is poorly conserved among human enolases, is immunogenic and is exposed to the solvent in the three-dimensional structure. Finally monoclonal antibody specificity was assessed by indirect ELISA using also other enolases like Saccharomyces cerevisiae and Trichomonas vaginalis.