Producción de enzimas proteolíticas por cultivo celular de jacaratia mexicana en un biorreactor de 6L

Abstract

RESUMEN: El cultivo de células vegetales es una herramienta biotecnológica en la producción de una gran variedad de metabolitos de interés comercial, entre los que se encuentran las enzimas. Las proteasas del látex de Jacaratia mexicana pueden competir en aplicaciones en la industria farmacéutica y alimentaria donde se emplea la papaína. J. mexicana es una planta silvestre que crece en regiones subtropicales de México. El objetivo de este estudio fue producir enzimas proteolíticas a partir del cultivo celular de J. mexicana en un biorreactor de tanque agitado de 6 L y establecer la composición optima del medio para el cultivo de callos y de células en suspensión de J. mexicana a nivel matraz.

En este trabajo se probaron cinco diferentes condiciones para la germinación de semillas de J. mexicana de las cuales el medio MS¼ en sales con un pretratamiento con H2SO4 presentó mayor porcentaje de germinación, ocho diferentes formulaciones del medio MS con los cuales se realizó el cultivo de callos y células en suspensión de J. mexicana a nivel matraz. El cultivo de callos se realizó en medio de Murashige y Skoog (1962) con 0.6% de agar, suplementado con 0.5 mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y 0.25 mg/L de BAP (6-benciladenina). Se probaron dos tipos de vitaminas MS y B5 1 mg/L. Se probaron cuatro diferentes concentraciones de fósforo (como KH2PO4) 0.340, 0.255, 0.170 y 0.085 mg/L. Con el medio MS+B5+P se obtuvieron las mayores tasas de crecimiento y actividad proteolítica en el cultivo de callos, con respecto al cultivo celular en suspensión con el medio MS+B5+P se obtuvo la mayor producción de biomasa, síntesis de proteína y actividad proteolítica; por lo tanto se eligió al medio de cultivo mencionado anteriormente para el cultivo en biorreactor de tanque agitado de 6 L. Se logro establecer el cultivo celular de J. mexicana en un biorreactor de tanque agitado de 6 L cuyas condiciones de operación fueron 0.5 vvm, velocidad de agitación 229 rpm, temperatura 27 °C; durante este cultivo se logro mantener la viabilidad celular de 85 a 90% así como también se observaron incrementos en la biomasa de 1.5 veces, en la proteína de 2.8 veces, y la actividad proteolítica de 2.7 veces a los 21 días de cultivo. Se obtuvieron valores de biomasa de 2.4 veces, similares de proteína y de actividad proteolítica de 3.9 veces mayores en comparación con el biorreactor de tanque agitado de 0.5 L con las mismas condiciones de operación. De los medios de cultivo en suspensión se recuperaron las enzimas proteolíticas y por electroforesis en gel de poliacrilamida se identificaron proteína(s) similar(es) en peso molecular a la proteasa cisteínica “mexicaína”, presente en el látex de J. mexicana. ABSTRACT: The plant cell culture is a biotechnological tools in the production of a variety of metabolites with commercial interest, among which are the enzymes. Proteases from latex of Jacaratia mexicana can compete in industrial applications which pharmaceutical and food where papain is used. Jacaratia mexicana is a wild plant that grows in subtropical regions of Mexico. The objective of this thesis was to investigate the formulation of Murashige & Skoog (MS) to give greater increases in biomass and proteolytic activity in callus and cell suspension cultures of Jacaratia mexicana in flask, in order to produce proteolytic enzymes from Jacaratia mexicana cell culture in a stirred tank bioreactor 6 L.

In this work we tested eight different formulations of MS medium for callus and cell suspension culture of Jacaratia mexicana in flask. The callus culture was performed on MS medium with 0.6% agar, supplemented with 0.5 mg/L of 2.4-D (2.4-dichlorophenoxyacetic acid) and 0.25 mg/L BAP (6-benzyladenine). Were tested two vitamins types MS and B5 1 mg/L. Were studied four different concentrations of phosphorus (as KH2PO4) 0.340, 0.255, 0.170 and 0.085 mg/L. The MS+B5+P showed the highest growth rates and proteolytic activity in the callus culture. With the MS+B5+P were had the highest biomass production, protein synthesis and proteolytic activity in cultured cells in suspension, so this formulation was selected for MS medium culture in stirred tank bioreactor 6 L . Results showed the Jacaratia mexicana cell culture in a stirred tank bioreactor 6 L at 0.5 vvm, agitation speed of 229 rpm, 27 °C during 21 days of culture and cell viability was maintained at 85 to 90%. And there were increases in biomass of 1.5 times, in protein synthesis 2.8 times, and the proteolytic activity of 2.7 times at 21 days of culture. Comparing these results with those obtained with the stirred tank bioreactor of 0.5 L with the same operating conditions show the following: in biomass production was 2.4 times higher in protein synthesis was similar and proteolytic activity through was 3.9 times higher. Proteolytic enzymes were recovered from the culture medium in suspension and were identified the proteins by polyacrylamide gel with similar molecular weight like cysteine protease "mexicain" present in the latex of Jacaratia mexicana.