Obtención de una construcción genética para generar una cepa de Candida glabrata SSK1∆

Abstract

RESUMEN: Candida glabrata actualmente es el segundo agente aislado más frecuentemente de infecciones superficiales e invasivas causadas por levaduras, después de Candida albicans, y presenta una resistencia innata a los derivados azólicos. El estudio de los sistemas de transducción de señales de dos componentes en hongos, ha revelado su participación en la respuesta a estrés ambiental y en la activación de diversos factores de virulencia. El estudio del gen SSK1 que codifica para la proteína reguladora de respuesta Ssk1 en C. glabrata, permitirá comprender la participación de ésta en la adaptación a diferentes condiciones de estrés ambiental. Para lo cual, se realizó un análisis in silico del gen SSK1 y de la proteína, el cual mostró que la proteína cuenta con un dominio tipo REC, ya descritos en los reguladores de respuesta. El análisis en la plataforma STRING 10 mostró que la Ssk1p puede interactuar con las proteínas de la vía HOG1 con las que hasta el momento no se había descrito una interacción directa. La plataforma MetaDisorder permitió observar el grado de ordenamiento en la estructura de la Ssk1p, observando que la región más ordenada correspondió a la zona del dominio REC. El análisis en el programa Mega reveló que la homología de la Ssk1p de C. glabrata es mayor con las especies de levaduras que se encuentran en su mismo clado como S. cerevisiae y Z. rouxii. Se diseñaron iniciadores específicos para la obtención de dos fragmentos de un tamaño de 400 pb pertenecientes a las regiones río arriba y río abajo que flanquean al gen SSK1 de C. glabrata. Igualmente se diseñaron los iniciadores que permitieron amplificar el cassette de resistencia a zeocina del plásmido pTEF1/Zeo. Posteriormente se evaluaron las condiciones adecuadas para fusionar estas tres secuencias mediante la técnica de PCR de doble fusión. La cepa de referencia de C. glabrata fue sometida a ensayos de adaptación a estrés osmótico y oxidativo con el fin de observar su efecto sobre el crecimiento. Así también, se evaluó la susceptibilidad a diferentes concentraciones de zeocina en medio sólido y líquido para determinar la concentración mínima inhibitoria que permitirá posteriormente seleccionar a las colonias transformantes.