ABSTRACT: Individuals from TB endemic countries had shown mycobacterial DNA in apparently healthy lung tissue, although they did not suffer the disease in whole life. Aside from macrophages, DNA was also present in other cells like endothelial, epithelial and fibroblasts. Already we have shown that mycobacteria is internalized into non-phagocytic cells by macropinocitosis, however yet it is not known with precision the mycobacterial component(s) that activates this endocytic pathway. The aim of this work was to analyze the macropinocytosis induction capabilities of three different Mycobacterium species: Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB), Mycobacterium smegmatis (MSM) and Mycobacterium abscessus (MABSC) and several protein and lipid components from M. tuberculosis H37Rv reported as important antigens for the pathogenesis of tuberculosis. Human pneumocyte type II (A549 cells) were stimulated with the mycobacterial components (recombinant proteins or pure lipids) and several features of the macropinocytic process were evaluated, eg., fluid phase uptake, cytoskeleton rearrangements, lamellipodia and macropinosome formation. Cytoskeleton rearrangement and micropinosomes were observed by confocal microscopy, changes in cell membrane morphology were analyzed by scanning electron microscopy, and nitric oxide (NO) and fluid phase uptake were evaluated by plate fluorometry. All three mycobacteria were interiorized by A549 cells stimulating macropinocytosis. However, MABSC stimulated macropinocytosis and NO production at highest degree. Induction of macropinocytosis is an active process since death mycobacteria was unresponsive. Two groups of Mtb H37Rv recombinant proteins were studied, secretion proteins (Ag85B, ESAT-6, APA and P16) or cell wall proteins (HBHA, PE-PGRS-33kDa), both groups stimulated macropinocytosis activity. As controls for the system, non-mycobacterial products like E. coli lipopolisacharide, bovine serum albumin, human serum albumin, egg albumin or recombinant protein sortase A from S. aureus were included and non-one of them induce macropinocytosis. None of the mycobacterium recombinant proteins studied stimulates NO production. Of the two mycobacterium lipids compounds studied, only sulfatide trigger macropinocytosis but at doses 5 times higher than those for proteins, mycolic acids did not induce cell membrane alteration but they induced a low NO production by the A549 cells. Our findings suggest that mycobacteria possess secreted and constitutive proteins and lipids that participate in the induction of macropinocytosis facilitating their entrance in the non-phagocytic cell and for the case of pathogenic bacteria for supporting their survival. In a future study, it is necessary to analyze proteins from non-pathogenic mycobacteria.
RESUMEN: En las zonas endémicas de TB, algunos individuos que jamás presentaran síntomas de la enfermedad, en estado post-mortem mostraron la presencia de DNA micobacteriano en diferentes estirpes celulares del tejido pulmonar, además de los macrófagos. Para explicar este fenómeno, estudios in vitro muestran que las micobacterias se interiorizan en la célula no fagocítica activando la macropinocitosis, aunque aún no se conoce el mecanismo por el que la micobacteria logra activar esta vía endocítica. El objetivo de este trabajo fue analizar algunos componentes proteicos y lipídicos de M. tuberculosis H37Rv (MTB), como posibles activadores de la macropinocitosis, simultáneamente se comparó la inducción de la macropinocitosis por tres especies de micobacterias de diferente patogenicidad (MTB H37Rv, M. smegmatis y M. abscessus). Las células no fagocíticas (neumocitos humanos tipo II) se pusieron en contacto con los diferentes estímulos y posteriormente se evaluó la captación de fase fluida y la producción de óxido nítrico (NO), en ambos casos se empleó la técnica de fluorometría en placa; el rearreglo del citoesqueleto se observó empleando técnicas de fluorescencia analizadas por microscopía confocal y la morfología de la membrana celular se evaluó por microscopía de barrido. Se encontró que las tres micobacterias se interiorizaron en las células A549 estimulando la macropinocitosis de forma diferencial, siendo M. abscessus, la especie que indujo la mayor interiorización y la mayor producción de NO. Estas propiedades sólo se observaron con las bacterias metabólicamente activas, con excepción de M. abscessus que conservó cierto grado de estímulo sobre la captación de fase fluida en la célula. Por su parte, las proteínas recombinantes de Mtb H37Rv, lograron inducir la macropinocitosis en las células A549, ya sea que fueran proteínas de naturaleza secretora (Ag85B, ESAT-6, APA y P16) o que formaran parte de la pared de la bacteria (HBHA, PE-PGRS33), la especificidad de la respuesta se corroboró utilizando lipopolisacárido de E. coli, proteínas no relacionadas a bacterias (albumina sérica humana, albúmina sérica bovina, ovoalbúmina) y una proteína bacteriana recombinante no relacionada al complejo tuberculosis (sortasa A de S. aureus), de estas ninguna disparó la macropinocitosis. En general, estas proteínas de MTB, no estimularon la producción de NO. Entre los lípidos de Mtb estudiados, sólo el sulfátido activó la macropinocitosis en la célula A549, aunque a una concentración más alta que la utilizada en las proteínas recombinantes. Los ácidos micólicos no causaron cambios morfológicos en la célula estimulada, aunque sí lograron estimular una ligera producción de NO. Estos resultados indican que las micobacterias poseen diversos componentes proteicos que participan importantemente en la activación de la macropinocitosis. Además, la micobacteria requiere un estado metabólico activo para lograr la inducción de esta vía endocítica. La baja producción de NO, por las proteínas y lípidos analizados sugiere que otros componentes micobacterianos son responsables de la inducción de la producción de este metabolito.
