ABSTRACT: Tuberculosis (Tb), is a disease caused by microorganisms belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). Nowadays, it is estimated that a staggering one-third of the world´s population is infected with some strain of the MTC. There is emerging evidence that fatty acids might be the dominant carbon source of Mycobacterium tuberculosis (M.tb) during dormancy. Therefore, the aim of the present study was to determine the gene expression of M. tb H37Rv in response to dormancy during hypoxic conditions in presence of sodium propionate or valerate. In order to achieve this objective, first of all, we verify that M. tb H37Rv was able to growth on propionate or valerate supplemented cultures. Then, the cultures were subjected to hypoxia, essentially as described by Wayne and Hayes. Total bacterial RNA was isolated from cultures during exponential and stationary phases of growth and during in vitro latency (hypoxia and anaerobiosis; NRP1 or NRP2, respectively). The expression of 19 genes of M.tb was quantified by real-time PCR. The expression profiles (normalized to the 16S rRNA) showed that on propionate, dnaA and fstZ genes were expressed higher in exponential phase and NRP2 stage than in the other conditions analyzed; the level of gene induction during NRP2 was not related to on increased of CFUs, suggesting that hypoxia might induce a bacteriostatic effect. Regarding rpfB gene, which encodes the resuscitationpromoting factor-like protein, we found a lower level of mRNA during phases related to stress than in exponential phase in both, with and without fatty acids; therefore, expression of this gene seems to be related to cell wall changes characteristic of non-replicative state of other microorganisms. Besides, an up-regulation of dormancy-related genes (dosR, hspX, Rv2626, Rv3134) was found in stationary phase and NRP2 (on propionate); in contrast, these genes were down-regulated when M.tb was cultivated on valerate. During these same stress conditions (Dubos media with propionate) the most relevant upregulation (8 and 21-fold higher respectively) was found in Rv3130 gene (related to biosynthesis and storage of tryacylglicerols) and also, in other genes, involved in biosynthesis and exportation of cell wall lipids as, mmpL7 (11-fold higher), groEL1 (11- fold) and fbpB (52-fold). In conclusion, these results indicate that during low oxygen tension (on propionate) M.tb H37Rv induces the synthesis of the storage lipid, triaciyglycerol that could be used during dormancy. In parallel, hypoxia also induces an increase of cell wall lipids. Overall, our results suggest that lipid metabolism may be a mechanism that M.tb may activate in order to survive throughout dormancy
RESUMEN: La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por micobacterias del “Complejo Mycobacterium tuberculosis” (MTC). Actualmente, se estima que la tercera parte de la población se encuentra infectada en forma latente con alguna cepa del MTC. Algunos estudios sugieren que los lípidos podrían jugar un papel fundamental durante la adaptación de M. tuberculosis (M.tb) a la latencia. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de la latencia inducida por hipoxia en presencia de propionato o valerato de sodio, sobre la expresión de algunos genes de Mtb H37Rv. Para cumplir con dicho objetivo, primeramente, se comprobó la capacidad de la cepa de crecer en presencia de dichos ácidos grasos; posteriormente, la micobacteria se cultivó hasta alcanzar la fase logarítmica de crecimiento y se expuso a condiciones de hipoxia fase NRP1) y anaerobiosis (fase NRP2) empleando el modelo de latencia in vitro de Wayne. Se procedió a extraer el RNA total en la fase logarítmica y estacionaria, así como durante la latencia in vitro, y se cuantificó la expresión de 19 genes de M.tb H37Rv mediante RTPCR en tiempo real. Los perfiles de expresión (normalizados con el rRNA 16S) mostraron que en presencia de propionato, los genes dnaA y fstZ presentaron una mayor expresión en la fase logarítmica y la fase NRP2; sin embargo, este aumento en la expresión en la fase NRP2, no se vió reflejado en un incremento en el número de UFC, es decir que la hipoxia induce un efecto bacteriostático. Respecto al gen rpfB, que codifica para un posible factor promotor de la reactivación, se detectó un menor número de transcritos durante las fases relacionadas con estrés, tanto en medio sin ácidos grasos como en medio adicionado de ellos, lo cual podría estar relacionado con algunos cambios morfológicos como el engrosamiento de la envoltura celular, fenómeno descrito durante la fase de persistencia no replicativa en otros microorganismos. En cuanto a los genes relacionados con hipoxia (dosR, hspX, Rv2626, Rv3134), durante la fase estacionaria y NRP2 (en presencia de propionato) se presentó una mayor actividad transcripcional que en ausencia de ácido graso; en tanto que la adición de valerato ocasionó una represión de estos mismos genes. En estas mismas fases (fase estacionaria y NRP2) se observó también una mayor sobreexpresión (8 y 21 veces respectivamente) del gen Rv3130 (relacionado con la biosíntesis y acumulación de triglicéridos) y de los genes mmpL7 (11 veces más transcritos), groEL1 (11 veces más transcritos) y para fbpB (52 veces más); estos últimos genes están relacionados con la biosíntesis de lípidos de membrana. En conclusión, los resultados encontrados sugieren que la falta de oxígeno y la presencia de propionato parecieran inducir en M.tb un aumento en la biosíntesis de lípidos de reserva que le ayudaran a persistir durante la latencia. En forma paralela, dicho estrés produciría un incremento en la biosíntesis de lípidos de membrana. Nuestros resultados sugieren que la micobacteria activa el metabolismo de lípidos para sobrevivir durante la latencia.
