Participación de los receptores tipo "toll" en el reconocimiento de lípidos asociados en partículas lipídicas

Abstract

ABSTRACT: Anionic phospholipids can adopt molecular arrangements different to the bilayer which is the arrangement of the lipids in the matrix of cell membranes. These molecular arrangements, or lipidic particles, are transient and by electron microscopy appear as protuberances on the smooth surface of the bilayer. When lipidic particles are stabilized they induce the production of anti-lipidic particle antibodies, which participate in the developed of an autoimmune-like disease resembling human lupus. Additionally, it had been detected anti-lipidic particle antibodies in the sera of patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and SLE secondary to the antiphospholipid syndrome. Thus, it is important to determine the mechanism of the recognition of the phospholipids in the association of lipidic particles by the immune system, both, because it is a mechanism that will recognize a tridimensional association of molecules of phospholipids, as well as by the participation of the anti-lipidic particle antibodies in the developed of an autoimmune disease in the mice and probably in the human. In order to analyze the mechanisms of the recognition of the tridimensional arrangement of the phospholipids in the lipidic particles, it was studied the roll of the Toll-like receptors, specially of the cell membrane receptors TLR2/6, TLR4, and TLR5, as well as the endosomal TLR8. Insofar as TLR4 can recognize the non-polar regions of their ligands, in particular the region of the hydrocarbon chains of the lipid A of the bacterial LPS, we considered that it can also participate in the recognition of the non-polar hydrocarbon chains of the phospholipids associated in lipidic particles. The dimer TLR2/6 recognizes among other ligands lipoproteins and lipoarabinomannan thus it is also possible that it can recognize to lipidic particles. As negative controls it was considered to TLR5 and TLR8 because they have to flagellin and viral RNA as ligands, respectively. The recognition of lipidic particles by the TLR’s was determined trough the activation of NF-B and by the production of IL-8 by the HEK-293 cells which expressed only one TLR. The TLR4 of the HEK-293hTLR4 cells recognizes to the phospholipids associated in lipidic particles in liposomes. The production of IL-8 after the recognition of lipidic particles was very similar to that attained with LPS; however, the activation of NF-B was 45% higher with lipidic particles than that with LPS. The antibiotic polymyxin B which produces the inhibition of the recognition of LPS by TLR4, also is an inhibitor of the binding of lipidic particles with this receptor. In addition, it was demonstrated that the lipidic particles do not disappear in the presence of polymyxin B, then the polymyxin B inhibition of the binding of these particles with TLR4 possibly is similar to the inhibition of the binding between LPS and TLR4. The demonstration that the liposomes with or without Mn2+are not contaminated with LPS (using the Lymulus method) is a strong support to the recognition of lipidic particles by the TLR4. Also it was demonstrated that TLR2/6, TLR5 and TLR8 of the cells HEK-293hTLR2/6, HEK293hTLR5 and HEK-293hTLR8 do not show any recognition of the phospholipids associated in lipidic particles. These findings let us to conclude that the non-polar hydrocarbon chains of the phospholipids of the inverted micelle of the particles have a tridimensional arrangement similar to the conic non-polar hydrocarbon chains of the lipid A, and that this hydrophobic and conic tridimensional arrangement is recognized by the TLR4 of the HEK-293hTLR4 cells.

RESUMEN: Los fosfolípidos aniónicos pueden adoptar asociaciones moleculares diferentes a la de bicapa que es la que integra la matriz de las membranas celulares. Estas asociaciones moleculares, o partículas lipídicas, son transitorias, por microscopía electrónica se observan como protuberancias sobre la superficie lisa de la bicapa; al hacerse permanentes, inducen la formación de anticuerpos anti-partículas que participan en el desarrollo de una enfermedad autoinmune en ratones parecida al lupus humano. Adicionalmente, se han detectado anticuerpos anti-partículas en sueros de pacientes con LES y LES secundario al SAAF. Por lo que es importante determinar el mecanismo de reconocimiento de los fosfolípidos asociados en partículas lipídicas por el sistema inmunitario, tanto porque es un mecanismo que reconoce a moléculas de fosfolípidos que se encuentran en una asociación tridimensional específica, como por la participación de los anticuerpos anti-partículas lipídicas en el desarrollo de una enfermedad autoinmune en el ratón y posiblemente en el humano. Para analizar los mecanismos que llevan al reconocimiento del arreglo tridimensional de fosfolípidos en partículas lipídicas, se estudió el papel de los receptores tipo Toll. Se analizaron TLR que se expresan en la membrana celular como TLR2/6, TLR4, y TLR5, así como el endosomal TLR8. Como el TLR4 reconoce las regiones no-polares de sus ligandos, en particular la región de cadenas hidrocarbonadas del lípido A del LPS bacteriano, consideramos que pueda participar en el reconocimiento de las regiones no-polares hidrocarbonadas de los fosfolípidos en partículas lipídicas. El dímero TLR2/6 reconoce entre otros ligandos a lipoproteínas y a lipoarabinomanana de origen bacteriano, por lo que es posible que también participe en este reconocimiento. Como controles negativos se consideraron el TLR5 que tiene como ligando natural la flagelina de bacterias gram negativas y el TLR8 que reconoce RNA de una cadena de origen viral. El reconocimiento de las partículas lipídicas por los TLR’s se determinó por la activación de NF-?B y por la producción de IL-8 por las células HEK-293 que expresan un solo TLR. El TLR4 de las células HEK-293hTLR4 reconoció a los fosfolípidos asociados en partículas lipídicas en liposomas. La producción de IL-8 resultante del reconocimiento de partículas lipídicas fue prácticamente igual a la obtenida con el LPS, el reconocimiento medido por la activación de NF-?B fue 30% mayor con partículas lipídicas con respecto al LPS. El antibiótico polimixina B que inhibe el reconocimiento del LPS por TLR4, también inhibió el reconocimiento de las partículas lipídicas por este receptor. Así mismo, se demostró que las partículas lipídicas permanecen en los liposomas en presencia de la polimixina B, por lo que la inhibición del reconocimiento de las partículas en presencia de este antibiótico posiblemente es similar al que ocurre con el LPS y no porque las partículas lipídicas cambien a la asociación de bicapa en presencia del antibiótico. La demostración de que los liposomas con o sin Mn2+ no están contaminados con LPS (con base en la prueba de Lymulus), es un fuerte apoyo al reconocimiento de las partículas lipídicas por el TLR4. Los TLR2/6, TLR5 y TLR8 de las células HEK-293hTLR2/6, HEK-293hTLR5 y HEK-293hTLR8 no reconocieron a los fosfolípidos asociados en partículas lipídicas. Estos hallazgos nos permiten concluir que la región de cadenas hidrocarbonadas no-polares de los fosfolípidos de la micela invertida de la partícula, comparte un arreglo tridimensional parecido a la región no-polar cónica de las cadenas hidrocarbonadas del lípido A, y este arreglo tridimensional hidrofóbico y de forma cónica es el reconocido por el TLR4 de las células HEK-293hTLR4.