Inducción de tolerancia inmunológica específica para un antígeno mediante una vacuna DNA

Abstract

RESUMEN: La terapia génica posee un gran potencial para el tratamiento de diversas enfermedades hereditarias. Este tipo de tratamiento basado en la introducción en un individuo de material genético nuevo, tiene algunos retos por vencer. Entre ellos se encuentran el evitar la respuesta inmunológica tanto al vector como hacia la nueva proteína transgénica. Se han propuesto diversas metodologías tendientes a evitar la activación de la respuesta immune posterior a la terapia génica. Algunas de ellas se basan en la utilización de vectores que inducen una baja respuesta inflamatoria, mientras que otras propuestas se dirigen a modificar la respuesta inmune del organismo. Las vacunas de DNA poseen propiedades inmunoregulatorias capaces de aumentar o suprimir una respuesta immune hacia una proteína transgénica. Se ha mostrado que la eliminación o metilación de secuencias CpG inmunoestimulatorias en los vectores plasmídicos evitan la aparición de anticuerpos hacia la proteína codificada por el vector. Con base en estos estudios previos, se ha utilizado una vacuna de DNA con las secuencias CpG metiladas con la finalidad de inducir tolerancia inmunológica hacia la proteína transgénica codificada por el mismo vector. En nuestra investigación, hemos encontrado que no hay activación de la respuesta immune en ratones posterior a inyecciones repetidas de dosis baja de un vector metilado que codifica una proteína altamente inmunogénica, como la glicoproteína del virus de la rabia (rab.gp). Inoculación de cantidades elevadas del vector metilado generaron una respuesta humoral de baja magnitud. Por su parte el vector no metilado indujo la producción de anticuerpos contra la rab.gp. Nuestros resultados también mostraron que la previa vacunación con el plásmido metilado, redujo la respuesta immune humoral y celular contra la proteína transgénica, aunque no la eliminó por completo ya que se recuperó parcialmente cuando se inoculó una vacuna no metilada y totalmente con adenovirus recombinantes expresando la proteína transgénica. Estos tratamientos constituyen un estímulo ligero y fuerte, respectivamente. Los resultados obtenidos no son consecuencia del cambio en el tipo de respuesta cooperadora entre TH1 y TH2, como demostraron el análisis del isotipo de los anticuerpos generados y el perfil de citocinas secretados por células esplénicas aisladas de ratones inoculados con los vectores. La posterior cuantificación de DNA y RNA en ganglios linfáticos, mostró que al inocular una vacuna de DNA metilada, el vector llega a los ganglios que drenan el músculo en menor proporción que la vacuna no metilada. Por su parte la expresión y por lo tanto la presentación del antígeno rab.gp fue similar con ambas vacunas, debido en gran parte al efecto del interferón gamma (IFN-γ). De manera interesante, solamente hubo expresión de moléculas coestimulatorias como CD 86 en ganglios linfáticos, al inyectar el vector no metilado. En conclusión, la vacunación con un vector plasmídico metilado interfiere con la activación de la respuesta immune humoral y celular, aunque no la elimina por completo. Los resultados son compatibles con un estado de tolerancia parcial cuyo mecanismo se debe a anergia, la cual es caracterizada por la incapacidad de producir IL-2 por parte de los linfocitos tras un estímulo antigénico in vitro. Esto último se produjo como consecuencia de la ausencia de coestimulación o señal 2 durante la presentación de antígeno. Finalmente, el efecto que tiene la administración de un vector metilado sobre el sistema inmune permite la expresión de una proteína transgénica por un periodo de tiempo prolongado, lo cual podría resultar útil en terapia génica cuando ésta se realice con vectores que no provoquen una respuesta inflamatoria considerable.

ABSTRACT: Gene therapy offers great potential for the treatment of many inherited human diseases. Despite great efforts, this modality of treatment is faced by two main challenges; transfer of sufficient copies of the replacement gene into specific target cell populations and longterm expression of therapeutic levels of the transgene product. Effectiveness of gene transfer protocols has been hampered by lack of sustained expresión of the transgene products. The immune response to vectors and transgene proteins plays a major role in the elimination of expression on the long term. Besides activating the immune response, DNA vaccines may also interfere with the differentiation, expansión or effector functions of B and T cells due to the immunoregulatory properties. It has been shown that the elimination or methylation of immunostimulatory CpG sequences in plasmid vectors abrogates the antibody response to the transgene in mice. In this study, we pursued the generation of antigen-specific tolerance to a transgene by initial priming with a methylated plasmidic vector. Repeated vaccination with a methylated DNA vaccine did not generate a humoral response and interfered, although not completely with the T and B cell activation by a subsequent boost with an unmethylated DNA vaccine coding for the same transgene. Nevertheless, the immune response was partially present upon administration of high doses of methylated vector and was fully restored by delivery of a recombinant adenovirus expressing the rab.gp protein completely reestablished the B cell response. Low responsiveness was not due to a skew of the TH1/TH2 response, as revealed by the isotype profile of the antibodies generated as well as the limphokines released by splenocytes in medium. Moreover, quantification of plasmidic DNA and RNA expression revealed a decreased uptake of the transgene to draining lymph nodes and a lack of costimulatory signals by a methylated DNA vaccine, despite similar levels of transgene expression during antigen presentation in lymph nodes by both vectors. Our results show that a methylated DNA vaccine induces a state of partial tolerance by a mechanism of anergy, which is characterized by diminished production of IL-2 upon antigen stimulation in vitro, and is induced by lack of co-stimulation during antigen presentation in lymph nodes. Modulation of the immune response by a methylated vaccine allows for long-term expression of the transgenic protein and could be a useful approach for gene therapy provided that the vector does not have high inflammatory properties.