Inducción de apoptosis en linfocitos T por células tumorales

Abstract

RESUMEN: El cáncer cervical es la primera causa de muerte por cáncer en las mujeres mexicanas, se ha mencionado al virus del papiloma humano (HPV) como agente causal de esta enfermedad. La respuesta inmune celular del huésped en especial la actividad biológica de los linfocitos T citotóxicos es de gran importancia, tanto frente a la infección viral, como frente a las células transformadas. El linfocito T citotóxico al encontrarse con su célula blanco es capaz de inducirle apoptosis por dos vías principalmente, una es por medio de la producción de perforinas y granzimas y la otra vía es a través de la interacción con el receptor CD95 (Fas). El receptor CD95, se encuentra en la superficie de la célula blanco y su ligando es la molécula CD95L (FasL) que se encuentra en el linfocito T citotóxico. Este ligando existe en dos formas biológicamente activas, la membranal y la soluble. El receptor CD95 se encuentra de manera normal en muchos tipos celulares, además del linfocito T citotóxico que también es susceptible de apoptosis cuando sufre daño o envejecimiento. Sin embargo, las células neoplásicas tienen mecanismos que les permiten evadir la respuesta inmune del huésped, entre éstos se encuentran la producción de moléculas inmunosupresoras, así como la utilización de la vía de señalización de CD95/CD95L. La célula transformada es capaz de inducir apoptosis en el linfocito T mediante el mecanismo de CD95/CD95L, ya que en la superficie de la célula transformada se encuentra sobre-expresado FasL e interacciona con su receptor, el cual está presente en forma legítima en el linfocito T citotóxico, de esta manera evade eficientemente la respuesta del huésped y las células malignas proliferan exitosamente en el organismo. Los objetivos de este trabajo son: 1) Determinar que las células transformadas de cáncer cérvico uterino inducen apoptosis a las células T y 2) Evaluar la participación del ligando de Fas en la evasión de la respuesta inmune celular. En este estudio empleamos como células inductoras de apoptosis las líneas celulares: SiHa y CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18), C-33 A (HPV negativo) y como células blanco de inducción de apoptosis, la línea celular Jurkat que juega el papel de célula inmune ya que se trata de una célula que pertenece al linaje del linfocito T. La apoptosis de células T (células Jurkat) se determinó mediante tinción con anexina VFITC/yoduro de propidio y tinción de TUNEL, ambas cuantificadas por citometría de flujo y valorando 10,000 eventos en cada caso, después de co-cultivarlas durante 24 horas con las diferentes líneas de células tumorales o sus sobrenadantes. En todos los cultivos mixtos de células de cáncer cervical con Jurkat se observó inducción de apoptosis significativa de las cel. linfoides; así como en la incubación de las cel. T con los sobrenadantes de los cultivos celulares. Con el objetivo de evitar la liberación de la forma soluble del ligando de CD95, utilizamos el inhibidor de las metaloproteasas de matriz extracelular. En estos experimentos se observó que las monocapas de las células de cáncer cervical indujeron apoptosis incluso más intensa en las cel. Jurkat, y que no se liberó a los sobrenadantes alguna molécula capaz de ejercer un efecto apoptótico en las cel. T. Para investigar si el ligando de CD95 participa en esta inducción de apoptosis sobre las cel. linfoides, utilizamos el anticuerpo anti-FasL para bloquear la actividad biológica del ligando tanto en la forma membranal como la soluble, en este caso observamos que en los cultivos celulares, el ligando de CD95 es el responsable de la inducción de apoptosis en las cel. Jurkat. Sin embargo en los sobrenadantes participa una molécula inmunosupresora diferente al CD95L que es capaz de ejercer un efecto apoptótico en las cel. T. Por lo que es importante explorar si se puede interferir en la expresión del CD95L en la membrana de las células transformadas, para contribuir en el diseño de nuevas terapias contra el cáncer cervical.

ABSTRACT: Cervical cancer is the leading cause of death due to cancer in Mexican women. The human papilloma virus (HPV) has been mentioned as a causal agent for this disease. The host’s cellular immune response, especially the biological activity of cytotoxic T lymphocytes, is particularly important in fending off both viral infection and transformed cells. On encountering its target cell, the cytotoxic T lymphocyte is capable of inducing apoptosis, mainly by two mechanisms: one through production of perforins and granzymes and the other through interaction with the CD95 (Fas) receptor. The CD95 receptor is located on the surface of the target cell and its ligand is the CD95L (FasL) molecule, which is found in the cytotoxic T lymphocyte. This ligand exists in two biologically active forms: the membrane associated protein and the soluble. The CD95 receptor is commonly found in many cell types, in addition to the cytotoxic T lymphocyte, which is also susceptible to apoptosis when it suffers damage or aging. However, neoplastic cells have mechanisms that allow them to evade the host’s immune response, which include production of immunosuppressor molecules and use of the CD95/CD95L signaling pathway. The transformed cell is capable of inducing apoptosis in the T lymphocyte by means of the CD95/CD95L mechanism, due to the presence on the surface of the transformed cell of overexpressed FasL, which interacts with its receptor, which is present in legitimate form in the cytotoxic T lymphocyte. Thus, it efficiently evades the host’s response and the malignant cells proliferate successfully in the organism. The objectives of this paper are: 1) To determine if transformed cervical uterine cancer cells induce apoptosis in T cells, and 2) To assess the participation of the Fas ligand in evasion of the cellular immune response. In this study we used as apoptosis inducing cells the cell lines: SiHa and CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18), C-33 A (HPV negative), and as target of apoptosis induction the Jurkat cell line, which plays the part of immune cell as it is a cell that belongs to the lineage of the T lymphocyte. T cell (Jurkat cell) apoptosis was confirmed by means of staining with annexin VFITC/propidium iodide and TUNEL assay, both quantified by flow cytometry and evaluating 10,000 events in each case, after co-culturing them for 24 hours with the different tumor cell lines or their supernatants. We observed significant induction of apoptosis in lymphoid cells in all the mixed cultures of cervical cancer and Jurkat cells, as well as in incubation of T cells with the supernatants from the cell cultures. To prevent the release of the soluble form of the CD95 ligand, we used an extracellular matrix metalloprotease inhibitor. In these experiments, we observed that cervical cancer cells expressing membrane associated CD95L induced even more intense apoptosis on Jurkat cells than untreated monolayers and supernatants of cancer cells treated with MMPI produced no apoptotic effect on Jurkat cells. To investigate whether the CD95 ligand participates in this induction of apoptosis in lymphoid cells, we used the anti-FasL antibody to block the ligand’s biological activity in both the membranal and soluble forms. In this case we observed that in the cell cultures the CD95 ligand is responsible for inducing apoptosis in the Jurkat cells; however, in the supernatants an immunosuppressor molecule different from CD95L participates, which is capable of producing an apoptotic effect in the T cells. For this reason, it is important to explore the possibility of interfering in CD95L expression in transformed cell membranes, to contribute to the development of new therapies for cervical cancer.