Caracterización de marcadores moleculares de progresión a tuberculosis pulmonar en pacientes con diabetes mellitus tipo 2

Abstract

ABSTRACT: Chronic degenerative diseases associated with aging and poor dietary habits of the population represent risk factors for the development of active pulmonary tuberculosis (APTB). Particularly, tuberculosis is 6.8 times more frequent among patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) and latent tuberculosis (LTTB) compared to individuals without DM2 and with LTTB. The proportion of APTB cases with DM2 varies from 1 to 9.3%. In Mexico the relative risk of developing APTB in patients with DM2 is 25%. The use of microarrays for the analysis of differential expression provides patterns of expression that can be considered the "transcriptional fingerprint" of a cell or a tissue in response to a specific stimulus. This fingerprinting can be used as a molecular marker for the diagnosis of certain diseases, or to predict progression of certain pathologies like APTB. Molecular markers have been identified for development of APTB in an experimental mouse model, although there are currently no available molecular methods to identify progression of LTTB to APTB in high-risk groups, including DM2. The purpose of this study includes the identification of molecular markers of progression to APTB in whole blood of patients with or without DM2, using microarrays. Microarrays were designed to contain genes of interest in a CustomArray 4x2k platform. Sixty blood samples were collected from individuals with and without DM2 including not infected (CTRL), latent tuberculosis (LTTB), and active pulmonary tuberculosis (APTB) individuals, which were selected under strict clinical and laboratory criterion. "PAXgene” tubes were used for the collection and preservation of blood and for isolation of RNA. The biotinylated cRNA was synthesized with the MessageAmpII-Biotin Enhanced aRNA system. Hybridizations were performed according to protocols of CombiMatrix and the values of hybridization were obtained with GenePix Personal 4100A scanner. Statistical analysis of results was carried out using SAM 1.15 software. Hierarchical clustering was performed using the programs Cluster and TreeView 1.60. Genes identified by microarray were confirmed by real-time RT-PCR. We identified 3 genes, HP, ITGB2, and CD14, associated to APTB progression in patients with DM2 from whole peripheral blood. These genes are able to discriminate patients with DM2 in either active or latent tuberculosis infection. In addition, due to their high degree of sensitivity and specificity, these biomarkers could be used to evaluate the effectiveness of TB-drug treatment in patients with DM2. The study identified two phases of progression from LTTB to APTB in the group of individuals with DM2. Finally, the results provide the basis for developing a simple diagnostic test that allows detection of patients with DM2 in the process of reactivating the LTTB.

RESUMEN: El desarrollo de enfermedades crónico degenerativas asociadas a la vejez y a los malos hábitos alimenticios en humanos, son factores de riesgo para el desarrollo de la tuberculosis pulmonar activa (TBPA). Así, se ha reportado que la tuberculosis es 6.8 veces más frecuente entre pacientes con diabetes mellitus (DM2) y con tuberculosis latente (TBLT), comparado con individuos sin DM2 y con TBLT. Actualmente, la proporción de casos de tuberculosis con DM2 en el ámbito mundial varía de 1 a 9.3%. En México, se reporta que el riesgo relativo de desarrollar TBPA debido a la presencia de DM2 es del 25%. El uso de microarreglos de DNA ha permitido identificar patrones de expresión que pueden ser considerados la “huella digital transcripcional” de una célula o de un tejido en respuesta a un estímulo específico, misma que puede utilizarse como marcador molecular para el diagnóstico de ciertas enfermedades, o bien, para predecir progresión en determinadas patologías como en la TBPA. En la actualidad no existen métodos moleculares disponibles para identificar la progresión de la TBLT a TBPA en grupos de alto riesgo, incluyendo DM2. Nuestro grupo ha identificado biomarcadores asociados al desarrollo de TBPA en un modelo experimental de ratón. Considerando lo anterior, la finalidad del presente trabajo fue identificar marcadores moleculares de progresión de TBLT a TBPA en sangre completa de individuos con o sin DM2, mediante el uso de la tecnología de microarreglos de expresión. En el trabajo se usaron microarreglos diseñados para contener genes de nuestro interés en formato CustomArray 4x2k de CombiMatrix. Se obtuvo sangre de 60 individuos con y sin DM2, tanto de individuos no infectados con M. tuberculosis (CTRL), con tuberculosis latente (TBLT) y con tuberculosis pulmonar activa (TBPA) previamente seleccionados bajo estrictos criterios clínicos y de laboratorio. Para la recolección y conservación de sangre y para el aislamiento del RNA, se usó el sistema “PAXgene”. El cRNA biotinilado se sintetizó con el sistema MessageAmpII-Biotin Enhanced aRNA. Se realizó la hibridación a chips de CombiMatrix y los valores de hibridación se obtuvieron con el escáner GenePix Personal 4100A. El análisis estadístico de los resultados se hizo con el programa “SAM 1.15”. Se realizó el agrupamiento jerárquico de genes con los programas “Cluster and TreeView 1.60”. Los niveles de expresión de los genes identificados por microarreglos se corroboraron por RT-PCR en tiempo real. Se identificaron 3 genes candidato de progresión de TBLT a TBPA en pacientes con DM2: HP, ITGB2 y CD14. Estos genes son capaces de discriminar pacientes con DM2, ya sea en estado latente o en estado activo de la infección tuberculosa. Por su alto grado de sensibilidad y especificidad podrían ser usados para evaluar la eficacia del tratamiento con antifímicos en pacientes con DM2. En el estudio se identificaron dos fases de progresión de la TBLT a TBPA en el grupo de individuos con DM2. Con estos resultados se sientan las bases para el desarrollo de una prueba diagnóstica simple que permita la detección de pacientes con DM2 en proceso de reactivación de la TBLT.