Fermentabilidad de almidón resistente tipo 3 en un modelo colónico in vitro y análisis de la comunidad microbiana implicada

Abstract

RESUMEN: En este trabajo, se evaluó la fermentación colónica en un sistema in vitro de almidón resistente tipo 3 (AR3) e inulina comúnmente utilizados como fibra dietética en la industria alimentaria. El AR3 se obtuvo de almidón nativo de maíz con 70% amilosa (Hylon VII) siguiendo un proceso hidrotérmico para la gelatinización y posterior retrogradación. Se cuantificó la fracción de almidón resistente en el almidón nativo (AR2) y en el almidón retrogradado (AR3), obteniendo un 9% y 29% de AR2 y AR3, respectivamente. Se realizó un tratamiento enzimático del almidón retrogradado simulando su digestión en la zona oral, estomacal e intestino delgado, controlando las condiciones propias de cada fase. Se cuantificó nuevamente el almidón resistente, obteniendo un 56.8% de AR3. Por otro lado, se implementó un sistema para realizar la fermentación in vitro que simuló el paso del almidón por el colon, empleándose heces de tres personas saludables como inóculo; la obtención de muestras se realizó mediante un protocolo y consentimiento informado avalado por el comité de bioética con dictamen DIP/802-2020. En total se estudiaron 9 sistemas de fermentación, 3 de ellos como control negativo empleando únicamente las muestras de heces. Se realizó una extracción de AGCC de las muestras tomadas a las 0, 4, 8, 12 y 24 h de la fermentación para cuantificarlos por CG-MS. Además, se llevó a cabo una extracción de ADN total tanto de la materia fecal como de las muestras al término de la fermentación in vitro de inulina y AR3. Se realizó una secuenciación de las 9 muestras a través de las regiones V3-V4 del marcador ribosomal 16S en la plataforma Illumina y se efectuó el análisis bioinformático a través de QIIME2, no encontrándose diferencia estadística en diversidad alfa. En diversidad beta tampoco se encontró diferencia en composición microbiana entre tratamientos, pero sí la hubo entre los taxones de los donadores (p=0.004). Los taxones predominantes en muestras con inulina y AR3 fueron del género Bifidobacterium y Escherichia-Shigella, mientras que algunos géneros de la familia Lachnospiraceae y Ruminococcaceae se vieron disminuidos en las fermentaciones de ambas fibras. Por otro lado, en promedio general de AGCC producidos, el acetato fue el mayor ácido cuantificado en la fermentación con AR3 e inulina, mientras que el butirato no incrementó, lo cual se relaciona con la composición microbiana. ABSTRACT: In this work, colonic fermentation was evaluated in an in vitro system of resistant starch type 3 (RS3) and inulin commonly used as dietary fiber in food industry. RS3 was obtained from native corn starch 70% amylose (Hylon VII), following a hydrothermal process for gelatinization and subsequent retrogradation. Resistant starch fraction was quantified in native starch (RS2) and retrograded starch (RS3), obtaining 9% and 29% of RS2 and RS3, respectively. An enzymatic treatment in retrograded starch was performed simulating its digestion in the oral, stomach and small intestine zone, controlling the conditions of each phase. Resistant starch was quantified again, obtaining 56.8% from RS3. On the other hand, a system was implemented to perform an in vitro fermentation that simulated the passage of starch through the colon, using feces from three healthy people as inoculum; samples were obtained following of a protocol and informed consent endorsed by the bioethics committee with code DIP/802-2020. A total of 6 fermentation systems were studied and the same 3 stool samples were used as negative control. An extraction of SCFA was performed from samples taken at 0, 4, 8, 12 and 24 h during fermentation and quantified by GC-MS. In addition, total DNA extraction was carried out from feces and samples at the end of in vitro fermentation of inulin and RS3. Sequencing of the 9 samples was carried out through the V3-V4 regions of the 16S ribosomal marker on the Illumina platform and bioinformatic analysis was performed through QIIME2, without obtaining statistical differences in alpha diversity. In beta diverstity, no difference in microbial composition was found between treatments, but there was a difference between donor taxa (p=0.004). The predominant taxa in inulin and RS3 samples were Bifidobacterium and Escherichia-Shigella genus, while some genera from Lachnospiraceae and Ruminococcaceae families were decreased in both fiber fermentations. On the other side, in overall average of SCFA produced, acetate was the highest acid quantified in RS3 and inulin, while butyrate didn’t increase, which is related to the microbial composition.