Diseño racional de una endolisina quimérica contra Vibrio parahaemolyticus

Abstract

RESUMEN: La resistencia bacteriana es una problemática particularmente crítica para bacterias patógenas Gram-negativas por la membrana externa que poseen. Por ello actualmente se ha propuesto como una alternativa el diseño racional de proteínas quiméricas para generar antimicrobianos con actividad potencializada y menor probabilidad de generar dicha resistencia. Y bajo esta premisa en este trabajo realizamos el diseño racional de una nueva endolisina quimérica (denominada LysVPMS1-PCNP), a partir del análisis estructural de la endolisina silvestre (LysVPMS1) proveniente del fago VPMS1. La cual se sabe ejerce actividad lítica sobre células sensibilizadas del género Vibrio. Esto con el objetivo de potencializar su actividad bacteriolítica contra Vibrio parahemolyticus, dado las serias pérdidas económicas que provoca esta bacteria en la industria acuícola. Para ello modificamos el dominio N-terminal de LysVPMS1 fusionando un péptido policatiónico (PCNP). Corroboramos el diseño realizando análisis in silico mediante acoplamiento molecular (Autodock vina 1.11.2) y observamos la presencia del aminoácido Glutámico 135 en los sitios catalíticos de LysVPMS1, el cual también se encontró presente en LysVPMS1-PCNP como Glutámico 144. Los modelos demostraron además que la nueva proteína es termodinámicamente estable y que el péptido se encuentra expuesto. Para probar la actividad primero se obtuvo la proteína recombinante y posteriormente se realizó un ensayo para medir la actividad muralítica relativa contra células sensibilizadas de V. parahaemolyticus, en donde la endolisina quimérica mostró 5.8 veces más actividad que la silvestre. Los resultados comprobaron que a partir del análisis in silico se puede realizar el diseño racional de una proteína quimérica, en donde además la modificación es estable ya que pudo ser producida vía recombinante. Obteniendo además una mayor actividad muralítica dado que esta nueva endolisina presenta mayor capacidad lítica sobre células sensibilizadas en un menor tiempo. ABSTRACT: Bacterial resistance is a particularly critical problem for pathogenic Gram-negative bacteria due to its outer membrane. Therefore, the rational design of chimeric proteins to generate antimicrobials with potentiated activity and a lower probability of generating said resistance has been proposed as an alternative. In this work we carried out the rational design of a new chimeric endolysin (called LysVPMS1-PCNP), from the structural analysis of the wild-type endolysin (LysVPMS1) from the phage VPMS1, which we know exerts lytic activity on sensitized cells of the genus Vibrio. To potentiate the bacteriolytic activity against Vibrio parahemolyticus, due to the serious economic losses caused by this bacterium in the aquaculture industry, we modified the N-terminal domain of LysVPMS1 by fusing a polycationic peptide (PCNP). We corroborated the design by performing in silico analysis by molecular coupling (Chimera 1.11.2) and observed the presence of the amino acid Glutamic 135 in the catalytic site of LysVPMS1, which was also found in LysVPMS1-PCNP as Glutamic 144. The models also showed that the new protein is thermodynamically stable and the peptide is exposed. The recombinant protein was obtained and the muralytic activity was tested against permeabilized cells of V. parahaemolyticus, where the chimeric endolysin showed 5.8 times more activity than the wild type. Our results proved that starting from in silico analysis, the rational design of a chimeric protein can be carried out, where the modification is also stable since it could be produced as a recombinant protein. Also enhancing muralytic activity since this new endolysin obtains greater lytic capacity on permeabilized cells in less time.